칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

요약

이 동영상은 모든 마운트 immunohistochemistry, 항원의 공간 및 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 태아의 시각 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다.

초록

여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브 및 체절 개발에 항체 표현을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 이 동영상은 HRP 복합 이차 항체를 사용하여 전체 마운트 항체 얼룩의 여러 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 내생 퍼옥시데이즈은 inactivated이며 배 (胚)는 다음 주 항체에 노출됩니다. 여러 세척 후, 배아는 HRP에 복합 보조 항체와 incubated입니다. 퍼옥시데이즈 활동 diaminobenzidine 기판과 반응을 사용하여 드러났습니다. 마지막으로, 배 (胚)는 고정하고 사진과 sectioning에 대한 처리됩니다. 형광 항체의 사용을 통해이 방법의 장점은 그 배아가 있으므로 단면의 항원 사이트의 연구를 지원, 왁스 sectioning에 대해 처리할 수 있습니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다

프로토콜

I. 도식 개요 :

이 비디오는 여자의 배아에서 전체 마운트 immunohistochemistry의 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 배아는 PFA에서 수정된 [IHC1]. 그런 다음, 내생 퍼옥시데이즈 활동은 침묵이다 [IHC2]. 배아는 다음 주 항체 [IHC3]에서 incubated입니다. 여러 세척 후 배아가 이차 항체에 incubated입니다 [IHC4]; 컬러 반응이 DAB [IHC5]를 사용하고 계시이며 항체 얼룩이 나타납니다 오렌지 [IHC6].

1 부 : 배아를 고정

1. 여자의 배아에 대한 전체 마운트 immunohistochemistry를 수행하려면 먼저 집게로 껍질을 감청하고 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다.
2. 포셉와 두꺼운 알부민을 제거하고, 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉로 난황을 기울.
3. 좋은 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고, PBS를 포함하는 접시에 장소.
4. 해부 현미경에서 신중하게 안정과 노른자와 PBS를 포함하는 신선한 요리로 배아 전송을 제거합니다.
5. 포셉 및 곤충 핀으로 배아를 핀, 그리고 PBS를 대기음. PBS에서 4퍼센트 PFA이로 교체하고, 배아는 RT에 1H를 해결하실 수 있습니다.

2 부 : 항체 단계에 대비하여 배아

1. 잠재적인 미생물 오염을 최소화하려면, 다음 단계에서 모든 ddH ₂ O를 사용합니다.
2. 배아가 수정되면 고정력있는 솔루션을 대기음 화학 폐기물을 적절히 처리. PBS로 요리를 입력합니다.
3. 다음, microdissection 나이프를 사용하여 extraembryonic 세포막을 제거하는 배아 주위에 사각형을 했네요. 포셉과 곤충 핀을 제거합니다.
4. 핀이 제거된 후, PBT (PBS 산도 7.4, 0.5 % 트리톤 X)를 포함하는 섬광의 약병에 배아를 전송하기 위해 뭉툭한 끝 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
5. 십분 각, PBT 3 번 배아를 씻으십시오.
6. 섬광의 병을에서 PBT를 제거하고, PBTx 잠재 내생 퍼옥시데이즈를 inactivate하기 위해 0.3 % H ₂ O _2를 포함하는로 바꿉니다.
7. nutator에 RT에서 2 시간을위한 부화.
8. 다음 PBT 10 분 각 3 회 30 분 각 3 회와 배아를 씻으십시오.

파트 3 : 항체 인큐베이션

1. 항체와 배아를 얼룩이, 차단 버퍼 또는 1% BSA / 1 % NGS / PBT (보조 항체가 염소에서 제기되기 때문에 우리가 NGS 사용) 한 시간 동안 배아를 세척하여 시작합니다. RT 한 시간 동안 nutator에 품어.
2. 4 이일 ° C nutator에이 솔루션에서 차단 버퍼 및 부화 배 (胚)의 기본 항체 1시 1분을 희석. 차 항체 희석 요소는 기본 항체의 선택에 따라 달라집니다. 여기서 우리는 supernatent대로 제시됩니다 발달 연구 브리 도마 은행에서 항체를 사용합니다. 우리는 버퍼를 차단에서 1시 1분을 희석.
3. 다음, PBT 3 1 시간 세척 다음 PBT 3 10 분 세척을 수행합니다.
4. 세척 후, 차단 버퍼에 보조 항체를 1:2500 희석 (이 경우 퍼옥시데이즈 복합 - 염소 항 마우스 IgG (H + L),이 솔루션에 품어 배아에서 4 O / N ° nutator에 C.
5. PBT 3 1 시간 세척 다음 PBT 3 10 분 세척을 수행합니다.

제 3 부 : 색상 반응

1. 스테인드 배아의 색상 반응을 개발하려면 먼저 트리스 버퍼 (100mM 트리스 HCL, 산도 7.4) 2 20 분 세척을 수행합니다.
2. 한편 펌 후드 아래에 500μg/ml의 트리스 버퍼에 DAB의 기판 (3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride) 디졸브, 어둠 속에서 솔루션을 유지, 얼음.
3. 병을 포함 배아에서 마지막 트리스 버퍼를 제거하고 세척 단계를 3.2에서 5ml DAB 솔루션으로 대체합니다. 20 MN에 대한 nutator에 어둠 속에 보관. DAB를 오염을 제거하다하기 위해 10 % 표백 용액이 들어있는 양동이에 Eppendorf 끝 처리.
4. 한편 0.3 %의 주식 얼음 DH ₂ O에서 H ₂ O _2를 준비합니다.
5. DAB의 배아를 포함 유리병에 50μl 재고 H ₂ O _2를 추가합니다. 어둠 속에 보관. 1~2분 후, 현미경으로 반응을 모니터링합니다.

4 부 : 사진 및 조직학에 대한 엠브료 처리

1. 색상 반응이 완료되면, 표백 양동이에 DAB 처분. 5 ML의 수돗물로 대체합니다.
2. PBS 2 10 분 세척을 수행합니다.
3. 사진 및 왁스 sectioning에 대한 처리하기 위해 10 분 각각에 대해 (25 %, 50 %, 75 % 및 100 %) 에탄올 시리즈 탈수.
4. 1 ML 시더 우드 오일 (이것은 배아 반투명하겠습니다) - 0.5와 에탄올을 대체합니다. 삼목 나무 기름의 사진을위한 과정입니다.
5. 사진 다음, 유리병에 배아를 반환하고 100 % 에탄올로 삼목 나무 오일을 교체하십시오. 에탄올 단계를 반복합니다.
6. E를 교체100 % 에탄올에 5% 빠른 그린 FCF와 thanol, 3 분 (이 단계는 조직학에 대한 배아 볼 것입니다)에 품어. 조직학에 대한 100 %의 에탄올과 프로세스 빠른 그린 FCF 솔루션을 교체합니다.

대표 결과 :

아래의 예제에서, 배아는 단계 HH 10 (A), 12 (B), 11 (C)에서 해부되며 태아는 몸의 신경 crestas에 PAX 7 표현을 보여주뿐만 아니라 somites과 신경 튜브 (A, B)에; 년 (C), notochord가 15.3B9합니다 (- 1) (발달 연구 브리 도마 은행에서 제공하는 항체)에 표시됩니다.

토론

이 동영상은 젊은 여자는 배아의 전체 마운트 항체 얼룩을 수행하는 다른 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 기본적으로 여자가 ^2,3의 소설 항체의 공간 및 시간적 특성을 위해 사용뿐만 아니라 모욕 ⁴ 다음 배아 기형을 결정하는 것으로 알려진 antigenic 마커의 사용입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs		Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Other	Lyon	RX
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
30% H2O2	Reagent	Sigma-Aldrich	H1009
BSA	Reagent	Sigma-Aldrich	A3803
NGS	Reagent	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Primary Antibodies	Reagent	Developmental Studies Hybridoma Bank	4G11, 15.3B9, PAX7	For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	34001	Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.
Cedar wood oil	Reagent	Sigma-Aldrich	W522503
Fast green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F7252
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20