Diese Arbeit wurde unterstützt von Grants-in-Aid for Young Scientists (A) (# 16680015), Grant-in-Aid for Exploratory Research (# 16653065), Grant-in-Aid for Scientific Research auf Schwerpunktbereiche (# 18023022, # 18016012 und # 18053015) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan, Grant-in-Aid aus Förderung der grundlegenden Studien in Health Sciences der National Institute of Biomedical Innovation (NIBIO), Grant-in- Hilfe aus Neuroinformatik Japan Center (NIJC), RIKEN

<ol><li> Die Geräte für die Hell / Dunkel-Übergangs-Test bestand aus einem Käfig (21x42x25 cm) in zwei gleich große Abschnitte durch eine Trennwand mit Tür (Ohara &amp; Co., Tokyo) unterteilt. </li><li> Mäuse sind drei vor vier pro Käfig in einem Zimmer untergebracht mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus (Licht an um 07.00 Uhr) mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Im Idealfall sind zwei Kontrollen und zwei Mutanten zusammen, durch Neuordnung der Mäuse, sobald sie zum Zeitpunkt der Entwöhnung sind genotypisiert untergebracht. Behavioral Tests erfolgt zwischen 9:00 Uhr durchgeführt und 06.00 Uhr alle Käfige mit Mäusen, um das Verhalten Testraum sind 30 min übertragen, bevor der erste Prozess beginnt. </li><li> Eine Kammer ist hell mit weißen Dioden (390 lux) beleuchtet, während die andere Kammer ist dunkel (2 Lux). Mäuse sind in der dunklen Seite gelegt und die Tür wird automatisch 3 Sekunden geöffnet, nachdem die Maus von der Infrarotkamera erkannt wird. Die Tür ist so, dass die Mäuse nicht in die Lichtkammer unmittelbar nach der Veröffentlichung mit ihrer Motivation, von Experimentator zu entkommen, da die Latenzzeit bis zum Lichtkammer geben als ein Index von Angst-ähnliches Verhalten dienen können verwendet werden. </li><li> Mäuse sind erlaubt, sich frei bewegen zwischen den beiden Kammern mit offener Tür für 10 min. Die Anwendung zur Erfassung und Analyse der Verhaltensdaten (Bild LD4) verwendet wird, auf den öffentlichen Bereich Image J-Programm (entwickelt byWayne Rasband am National Institute of Mental Health und unter http://rsb.info.nih.gov/ij Basis /), die von Tsuyoshi Miyakawa (verfügbar über O&#39;Hara &amp; Co., Tokyo, Japan) geändert wurde. </li><li> Die Strecke in jeder Kammer, die Gesamtzahl der Übergänge, verbrachte die Zeit in der jeder Kammer, und die Latenzzeit, das Licht chamberare von Image LD4 Programm aufgezeichnet geben. </li><li> Nach jedem Versuch sind alle Kammern mit super unterchlorige Wasser gereinigt, um eine Vorspannung auf Geruchssinn Basis zu verhindern. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Alle Verfahren wurden durch die Verwendung von Tieren und Pflege Ausschuss der Universität Kyoto gebilligt. Tsuyoshi Miyakawa mit BIRD, Japan Science and Technology Agency, Saitama, Japan verbunden.

Obwohl alle Maus-Genom-Sequenzen bestimmt wurden, sind die Funktionen der meisten dieser Gene nicht bekannt. Gene-Targeting-Techniken kann jedoch verwendet werden, um zu löschen oder manipulieren ein bestimmtes Gen in Mäusen (Aiba et al, 2007.; Austin et al, 2004.) Werden. Der Einfluss eines bestimmten Gens zu einem bestimmten Verhalten kann dann durch die Durchführung Verhaltensanalysen des mutierten Mäusen (.; Takao et al, 2007 Takao und Miyakawa, 2006) ermittelt werden. Als Test für die Verhaltens-Phänotypisierung von Mausmutanten, die Hell / Dunkel-Übergangs-Test einer der am häufigsten verwendeten Tests zur Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen (Crawley, 2000) zu messen. Der Test basiert auf der natürlichen Abneigung der Mäuse zu hell beleuchteten Bereichen und auf ihre spontane Erkundungsverhalten in neue Umgebungen (Crawley, 1985) basiert. Der Test ist empfindlich auf anxiolytische medikamentöse Behandlung (Crawley, 1985). Der Apparat besteht aus einer dunklen Kammer und eine hell erleuchtete Kammer. Eine eingeschränkte Öffnung, 3 cm hoch und 5 cm breit, verbindet die beiden Kammern. Mäuse sind erlaubt, sich frei bewegen zwischen den beiden Kammern. Die Anzahl der Einträge in das helle Kammer und die Dauer der Zeit gibt es in Form von Indizes von hell-Raum Angst in Mäusen verwendet. Der Hell / Dunkel-Übergangs-Test wurde ursprünglich von Crawley und Kollegen (Crawley und Goodwin, 1980) entwickelt. Es gibt zwei Unterschiede zwischen der Originalfassung und unser Test. Zuerst wird das Licht Kammer größer als die dunkle Kammer, in der ursprünglichen Version, während die Größe der beiden Kammern ist der selbe in unserer Version des Tests. Zweitens, in der ursprünglichen Fassung hatte der Lichtkammer keine Decke und den Wänden der Lichtkammer wurden transparent (Crawley und Goodwin, 1980), während wir Deckweiß Kunststoff für die Decke und den Wänden der Lichtkammer verwenden. Diese Unterschiede, nämlich die Größe und die Offenheit der Lichtkammer, für den gleichzeitigen Nachweis von hell-Raum Angst sowie Open-Space-Angst in der ursprünglichen Version des Tests zu ermöglichen. In unserem Labor, aber Open-Space-Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen in einer erhöhten Plus-Labyrinth getestet. Das undurchsichtige Wände und die Decke, Größe der Lichtkammer und unsere spezifischen hell / dunkel Übergang Testprotokoll ist spezialisierter zum Nachweis von hell-Raum-Angst im Vergleich zu der ursprünglichen Version. Obwohl die Hell / Dunkel-Übergangs-Test und erhöhten Plus-Labyrinth sowohl für die Beurteilung der Angst-Verhalten eingesetzt werden, sind die Ergebnisse nicht immer konsistent. Zum Beispiel verbringen Vorderhirn-spezifischen Calcineurin knockout Mäuse eine verringerte Menge an Zeit in das Licht Kammer in der Hell / Dunkel-Übergangs-Test, sondern eine erhöhte Menge an Zeit in die offenen Arme in die Elevated Plus Maze (Miyakawa et al., 2003) . Wir stellten die Hypothese, dass unsere Hell / Dunkel-Übergangs-Test und erhöhten Plus-Labyrinth-Tests unterschiedliche Aspekte von Angst-ähnliches Verhalten, wie hell-Raum Angst und Open-Space-Angst-ähnliches Verhalten zu beurteilen. Um diese Hypothese zu testen, haben wir eine große Datenmenge gesammelt mit den gleichen Mäusen in beiden Tests. In unserem Labor führen wir Verhaltenstest Batterien, die viele Domains auf dem Bildschirm für die Verhaltens Bedeutung der Gene. Die Testbatterie erfordert mehrere Wochen dauern. Während der Testphase werden Mäusekäfige auf einem Gestell in unserer Einrichtung aufbewahrt. Wenn Mäuse an unser Labor von anderen Institutionen transportiert werden, sind sie für die Umwelt unserer Anlage für mindestens 1 Woche gewöhnt. Nach der Gewöhnung Zeitraum, sind Mäuse, eine allgemeine Gesundheits-Check und neurologischen Screening (Miyakawa et al., 2003) unterzogen, und nach dieser einfachen Untersuchungen, Mäuse sind die Hell / Dunkel-Übergangs-Test unterzogen. Der Test wird in einer schalldichten experimentellen Raum nach 30 min der Gewöhnung an die experimentellen Raum durchgeführt, wie im Film gezeigt. Wir haben mehr als 60 Stämme von gentechnisch mutierten Mäusen unter Verwendung des Protokolls in dem Film gezeigt, bewertet und haben eine große Menge von Rohdaten für mehr als 3000 Mäuse (einschließlich Wildtyp-und mutierten Mäusen). Wir haben Faktorenanalysen, die Vorteile der großen Menge von Rohdaten zu nehmen. Tatsächlich entdeckten wir verschiedene Faktoren, die von jedem Test (unveröffentlichte Daten), obwohl es einige signifikante Korrelationen zwischen den Indizes (unveröffentlichte Daten) .. Diese Daten werden im Rahmen einer öffentlichen Datenbank, die wir jetzt bauen werden offen gelegt werden. In unserem Test-Batterie sind Wildtyp-Geschwister in der Regel als Kontrolle verwendet. Als Hintergrund-Stamm, sind C57BL/6J-Mäuse häufig verwendet. Wir sammelten die Daten von C57BL/6J-Mäuse als Kontrolle von Mausmutanten in der Testbatterie verwendet. Die Indizes von C57BL/6J-Mäuse in unserem hell / dunkel Übergang Test waren wie folgt (n = 795; bedeuten, SEM); Strecke: 846,5 8.88 cm im Lichte Kammer, 1478,5 9,53 cm in die dunkle Kammer, Dauer der Zeit : 215,8 1.85 Š in das Licht, 395,8 1,86 s im Dunkeln; Anzahl der Übergänge zwischen den Kammern: 30.52 0,43; Latenz, um das Licht Kammer eintreten: 64,94 2,40 s. Die Bewegung der Maus rund um die Eingänge zu den Kammern wird von der Kamera erkannt wird und im Laufe der Zeit in beide c verbracht gezähltHambers. Aus diesem Grund verbrachte die Summe der mittleren Dauer der Zeit in das Licht und die, die in dunklen Kammern war größer als die der gesamten Dauer des Tests (600 s). In unserem Protokoll ist eine Maus zuerst in die dunkle Kammer platziert. Drei Sekunden nachdem Sie mit der Maus in die dunkle Kammer, die Tür zwischen den Kammern automatisch geöffnet und die Maus frei bewegen kann zwischen den beiden Kammern. C57BL/6J-Mäuse verbringen weniger Zeit in das Licht Kammer als in der dunklen Kammer (p &lt;0,0001, Dauer, wenn die Zeit in Licht verbracht: 215,8 1.85 Š, der Dauer der Zeit in dunklen verbracht: 316,3 2,11 s [die Zeit im Dunkeln verbracht hat nicht die erste Zeit in der Dunkelheit vor dem Eintritt in die Lichtkammer zum ersten Mal], n = 795, gepaarten t-Test) ausgegeben. Dies deutet darauf hin, dass C57BL/6J-Mäuse die Lichtkammer meiden, und dass die Zeit in das Licht ist ein guter Index der Angst-ähnliches Verhalten. Die Ergebnisse aus verschiedenen Stämmen von mutierten Mäusen gewonnen werden leicht verglichen werden, da alle erhaltenen Daten sind mit dem gleichen Protokoll. Um Phänotypisierung Ergebnisse eines Stammes von mutierten Mäusen, die leicht reproduzierbar und im Vergleich mit Daten von anderen Mutanten, sollte das Verhalten Prüfverfahren werden so identisch wie möglich zwischen den Laboratorien. Crabbe und seine Kollegen testeten die Interaktion zwischen Verhalten der Maus und Labor-Umgebung mit genau der gleichen Inzuchtstämme und eine Null-Mutante. In ihrer Studie wurden die Apparate, Prüfprotokolle und viele Umgebungsvariablen streng standardisiert. Trotz der Standardisierung, fanden sie eine systematische Unterschiede im Verhalten zwischen Laboratorien, obwohl sie erkannt auch unterschiedliche Stämme in alle Verhaltensweisen (Crabbe et al., 1999). Sie berichteten, dass unkontrollierbare Variablen und Experimente charakterisieren Mutanten können die Ergebnisse, dass idiosynkratische zu einem bestimmten Labor ergeben. Die verfahrensrechtlichen Unterschiede zwischen den Labors gibt es schwierig zu replizieren oder vergleichen Sie die Ergebnisse von Labor zu Labor. Hier präsentieren wir unsere Protokoll für die Hell / Dunkel-Übergangs-Test als einen Film, so dass die Details des Protokolls nachgewiesen werden kann. Gründung visuelle Dokumentation des Protokolls wird eine bessere Verständigung über die Einzelheiten der experimentellen Verfahren, ermöglicht eine Standardisierung der Protokolle über Labors und für Vergleiche des Verhaltens Phänotypen verschiedener Stämme von mutierten Mäusen beurteilten mit Hilfe dieses Tests. Filme von anderen Protokollen, wie zum Beispiel für die erhöhten Plus-Labyrinth, offene Feldversuch Porsolt Forced Swim Test, Angstkonditionierung, dass wir in unserem Verhalten Testbatterie werden derzeit zur Veröffentlichung als zukünftige Video Zeitschriftenartikeln gemacht.

light/dark transition test for mice

Obwohl alle Maus-Genom-Sequenzen bestimmt wurden, wissen wir noch nicht wissen, die Funktionen der meisten dieser Gene. Gene-Targeting-Techniken kann jedoch verwendet werden, um zu löschen oder manipulieren ein bestimmtes Gen in Mäusen werden. Der Einfluss eines bestimmten Gens zu einem bestimmten Verhalten kann dann durch die Durchführung Verhaltensanalysen der mutierten Mäusen bestimmt werden. Als Test für die Verhaltens-Phänotypisierung von Mausmutanten, die Hell / Dunkel-Übergangs-Test einer der am häufigsten verwendeten Tests zur Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen zu messen. Der Test basiert auf der natürlichen Abneigung der Mäuse zu hell beleuchteten Bereichen und auf ihre spontane Erkundungsverhalten in neue Umgebungen. Der Test ist empfindlich auf anxiolytische medikamentöse Behandlung. Der Apparat besteht aus einer dunklen Kammer und eine hell erleuchtete Kammer. Mäuse sind erlaubt, sich frei bewegen zwischen den beiden Kammern. Die Anzahl der Einträge in das helle Kammer und die Dauer der Zeit gibt es Indizes der Hell-Raum Angst bei Mäusen. Um Phänotypisierung Ergebnisse eines Stammes von mutierten Mäusen, die leicht reproduzierbar und vergleichbar mit denen anderer Mutanten, sollte die Verhaltens-Prüfverfahren werden so identisch wie möglich zwischen den Laboratorien. Die verfahrensrechtlichen Unterschiede zwischen den Labors gibt, machen es jedoch schwer zu replizieren oder vergleichen Sie die Ergebnisse von Labor zu Labor. Hier präsentieren wir unsere Protokoll für die Hell / Dunkel-Übergangs-Test als einen Film, so dass die Details des Protokolls nachgewiesen werden kann. In unserem Labor haben wir mehr als 60 Stämme von mutierten Mäusen unter Verwendung des Protokolls in dem Film gezeigt, beurteilt. Diese Daten werden als Teil einer öffentlichen Datenbank, die wir jetzt bauen werden offen gelegt werden. Visualisierung des Protokolls erleichtern das Verständnis der Details des gesamten experimentellen Verfahren, ermöglicht eine Standardisierung der Protokolle über Labors und Vergleiche der Verhaltens-Phänotypen der verschiedenen Stämme von mutierten Mäusen beurteilten mit Hilfe dieses Tests.

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Light/dark Transition Test for Mice

Der Hell / Dunkel-Übergangs-Test ist eine der am häufigsten verwendeten Tests zur Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen zu messen. Hier präsentieren wir einen Film, der detaillierte Verfahren, wie wir Verhalten der Test zeigt.

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

52.3K Aufrufe.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. He did. So what?

Serie: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Elevated Plus Maze für Mäuse

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Forschung

Biologie

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Mausmodell für Morbus Parkinson: von 6-OH Dopamin Läsion Behavioral-Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Transkript

Zusammenfassung

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