Finanziato da una sovvenzione da parte del National Science Foundation a MF

L&#39;OMT è un adattamento di un sistema di legare magnetico 1, intesa a incorporare un simulatore virtuale 2 pennacchio. I seguenti protocolli spiega come ottimizzare le immagini video acquisite (Parte 1) ed eseguire due tipi di base visuo-olfattiva esperimenti (parte 2 e 3). Parte 1: Acquisizione Video Ottimizzare l&#39;immagine video è di fondamentale importanza per la qualità dei dati acquisiti. Seguire questi passaggi per immagini più nitide. <ol><li> Mettere una mosca appena legato in campo con un paio di pinze. </li><li> Posizionare la firewire board camera (Fuoco-I 1394store.com) sotto la camera a vuoto in acrilico trasparente in modo che la telecamera è direttamente verso l&#39;alto attraverso la camera, attraverso un tubo di vetro, per l&#39;aspetto ventrale della mosca legato. Assicuratevi che non ci sia rivestimento filtro IR sull&#39;obiettivo del sistema video. </li><li> Per illuminare il volo, utilizzare un array circolare di LED a infrarossi (Small-Parts Inc) posizionato appena sotto i pannelli a LED. Attenzione ogni LED sul corpo della mosca individualmente per un&#39;illuminazione uniforme. </li><li> Per ridurre i riflessi dal sistema di pannello e per ridurre al minimo segnali visivi osservato dalla mosca, è utile per ricoprire tutte le superfici riflettenti all&#39;interno della telecamera con vernice nera opaca. Luci della stanza deve essere spento per ridurre l&#39;abbagliamento e modulazioni luminosità rilevabile ad occhio della mosca. </li><li> Ispezionare visivamente l&#39;immagine della telecamera. La mosca dovrebbe essere bianco luminoso su uno sfondo nero. Se l&#39;immagine è sfocata la lente può essere necessario a fuoco. Se il volo è scuro, la matrice di LED può essere sfocata o non sufficientemente alimentato per l&#39;illuminazione adeguata. Se lo sfondo contiene oggetti luminosi, montare un disco di carta gregge nero appena sopra al volo per minimizzare riflessione di fondo. </li><li> Noi acquisire video con subroutine personalizzati scritti in Matlab utilizzando la casella degli strumenti di acquisizione di immagini. </li></ol> Parte 2: La mosca trovare il pennacchio odore Un semplice esperimento in OMT si assiste ad un affamato (affamato) volano localizzare e poi attivo il monitoraggio di un pennacchio di odore di cibo attraente. Manipolando l&#39;ambiente influenza la capacità visiva della mosca di tenere traccia con fermezza un odore appetitivo cibo. Si noti che gli esperimenti sono tipicamente eseguiti in un formato blocco casuale di ridurre al minimo ogni pregiudizio in ordine sperimentale. Tutto l&#39;hardware esterno (multiplexer gas, arena LED, acquisizione video) sono controllati da routine software personalizzati scritti in Matlab (Mathworks). <ol><li> Mettere una mosca appena legato in campo con un paio di pinze. </li><li> Prima di ogni esperimento, con un&#39;indicazione sul display, ruotare il volano per alcuni giri 3 per garantire un movimento fluido intorno l&#39;intero asse di imbardata 360. Se il volo non gira senza problemi lo scarto. Se il problema persiste, la causa probabile è magneti allineata. Nota: Se la distribuzione di campo in direzione di traiettorie diverse nel corso del processo di spin mostra picchi significativi (cioè non è piatto a 360 gradi), molto probabilmente c&#39;è un bias di orientamento a causa di magneti allineati. </li><li> Presente al volo con le seguenti condizioni campione sperimentale in ordine casuale: i) ad alto contrasto modello a strisce con il vapore acqueo proveniente dal porto odore, ii) ad alto contrasto motivo a righe con odore di vapore attraente; iii) una striscia singola offset verticale di 90 gradi dall&#39;ugello vapore acqueo, e iv) una singola striscia di offset di 90 gradi con vapore odore. Nella nostra esperienza, intervalli di 30 secondi funzionano bene per gli esperimenti in cui sono sfidati vola a individuare la fonte degli odori per conto proprio. Noi acquisire video a 30 Hz per la durata di ogni condizione sperimentale e analizzare le immagini in linea con le routine software personalizzato scritto in Matlab (una delle più utili funzioni built-in Matlab è regionprops.m che analizza le proprietà geometriche di un&#39;ellisse. </li><li> Quando si usano concentrazioni elevate odore, l&#39;odore residuo può essere rilasciato dal porto odore dopo che l&#39;odore è spento. Per minimizzare eventuali effetti che questo può avere, è utile per far girare al volo per qualche secondo con un panorama di rotazione per consentire al sistema per scovare ogni odore residuo. </li><li> E &#39;utile anche per ruotare visivamente al volo tra i trattamenti sperimentali (i) mantenere le mosche attivamente impegnati nella sperimentazione e di (ii) mantenere vola da rimanere fermi in un posto. Un esperimento esempio può avere il seguente ordine: i) ventiduesimo giro iniziale di diagnosi; ii) cinque secondo giro intermedi; iii) venti coppia seconda condizione # 1; iv) cinque secondo giro intermedi; v) venti coppia seconda condizione # 2. </li></ol> Parte 3: La mosca rimanendo entro il pennacchio odore Un secondo esperimento di base nella OMT è quello di trascinare visivamente una mosca in un pennacchio odore, istantaneamente il cambiamento delle condizioni visive, e quindi misurare la sua capacità di rimanere nel pennacchio. Anche in questo caso, si noti che tutti gli esperimenti vengono eseguiti in un blocco casuale format per minimizzare ogni pregiudizio in ordine sperimentale. <ol><li> Mettere una mosca appena legato in campo con un paio di pinze. </li><li> Visivamente ruotare (spin) i tempi di volo diversi in tutto il campo prima di ogni esperimento come un controllo diagnostico per garantire che l&#39;animale ha la capacità di orientarsi in ogni direzione (cfr. parte 2.2). </li><li> Prima di ogni condizione, accendere l&#39;odore sperimentale (acqua o aceto) e visivamente &quot;trascinare&quot; la mosca nel pennacchio da oscillanti una piccola striscia verticale in corrispondenza della posizione del pennacchio. Questa sfrutta il comportamento potente fissazione striscia osservato nei moscerini [4]. </li><li> Ora che il volo è orientata verso il pennacchio, rimuovere la striscia oscillante e presentano le condizioni di esempio seguente visiva: i) strisce ad alto contrasto panoramica con il vapore acqueo (Fig. 1A), ii) sfondo uniforme con il vapore acqueo (Fig. 1B); iii) strisce ad alto contrasto panoramica con l&#39;odore del vapore (Fig. 1C), iv) di sfondo uniforme, con odore di vapore (Fig. 1D). Acquisire video come in 2.3. Un esperimento esempio può avere il fluire ordine: i) ventiduesimo giro diagnostica iniziale, ii) cinque secondi oscillazione striscia pennacchio, iii) venti coppia seconda condizione # 1; iv) cinque secondi oscillazione striscia pennacchio; v) venti coppia seconda condizione # 2 . </li></ol> Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/old/1110_2009_1_22_1/Fig 1.png" alt="Figura 1" width="600" height="195" /> Figura 1 Parte 1 spiega come ottimizzare le immagini video OMT. L&#39;immagine video deve avere una chiara visione della mosca illuminato su uno sfondo scuro nero. Eccessivamente immagini luminose può essere migliorata riducendo le interferenze di fondo, riducendo l&#39;intensità dei LED a infrarossi, o spegnendo le luci della stanza. Se il volo è illuminato in modo improprio, regolando la messa a fuoco dei LED IR o modulando l&#39;intensità dei LED IR potrebbe risolvere il problema. Parti 2 e 3 descrivono per condurre semplici esperimenti per verificare il corretto funzionamento di un OMT. In tutti i casi, una mosca dovrebbe essere visivamente &quot;forzato&quot; (via risposte optomotor) per ruotare alcuni giri in campo per garantire un regolare e completa gamma di movimento. Nella parte 2 una mosca è sfidato a trovare un pennacchio odore di per sé. Per mantenere il volo impegnati nell&#39;esperimento, per ridurre l&#39;effetto del rilascio di odori residui, e per mantenere vola da mantenere una sola voce tutto l&#39;esperimento, è utile per ruotare visivamente al volo per alcuni secondi tra prove. Una mosca non dovrebbe mai localizzare un pennacchio di vapore acqueo in misura significativa, e deve sempre localizzare un pennacchio di odore in presenza di ricchi spunti visuali panoramiche. Nella parte 3 una mosca è visivamente trascinato direttamente in un pennacchio odore e sfidato a mantenere la sua voce all&#39;interno del pennacchio contro una varietà di ambienti visuali fisse. Se il volo viene trascinato in un pennacchio di vapore acqueo, dovrebbe allontanarsi rapidamente. Se il volo viene trascinato in un pennacchio odore e non ci sono sufficienti indizi visivi per mediare inseguimento robusto, la mosca rimarrà nel pennacchio.

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>G&#246;tz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Course-control,+metabolism+and+wing+interference+during+ultralong+tethered+flight+in+Drosophila+melanogaster.">Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).</li></ol>

L&#39;acquisizione delle immagini di questo sistema utilizza una telecamera a bordo poco costoso firewire e software scritto in Matlab. Immagini chiare sono cruciali per ottenere precise tracce di dati. Le strategie sopra descritte sono utili per ripulire le immagini in questo sistema. Altri video di procedure di monitoraggio per questo sistema sono stati descritti 1. Inoltre, questo sistema potrebbe essere facilmente modificato per includere in tempo reale il monitoraggio video. I protocolli sperimentali ese...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Firewire camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1394store.com</td>
<td>Fire-I board camera BW</td>
<td>4.3mm lens no IR coating</td>
</tr>
<tr>
<td>IR LEDs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Black spray paint</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rustoleum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Flat black</td>
</tr>
<tr>
<td>Black flock paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edmund Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Panel system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3</td>
</tr>
<tr>
<td>Matlab 2006a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Image acquisition toolbox</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visually mediated odor tracking during flight in drosophila

Insetti volanti utilizzare segnali visivi di stabilizzare la loro voce in un flusso di vento. Molti animali inoltre traccia odori portato dal vento. Come tale, la stabilizzazione visiva di bolina monitoraggio direttamente aiuti nel monitoraggio degli odori. Ma i segnali olfattivi influenzano direttamente il comportamento visivo di tracciamento indipendente di spunti vento? Inoltre, recenti progressi nella olfattiva genetica molecolare e la neurofisiologia hanno motivato romanzo analisi quantitative comportamentali per valutare l&#39;influenza del comportamento di (ad esempio) geneticamente inattivando specifici circuiti di attivazione olfattiva. Abbiamo modificato un sistema magnetico tether originariamente ideato per gli esperimenti di visione dotando l&#39;arena con pennacchi strette a flusso laminare odore. Qui ci concentriamo su esperimenti che può essere eseguita dopo una mosca è legato ed è in grado di navigare in campo magnetico. Mostriamo come acquisire immagini video ottimizzato per la misurazione dell&#39;angolo del corpo, come giudicare il monitoraggio stabile odore, e ci illustrano due esperimenti per esaminare l&#39;influenza dei riferimenti visivi sul monitoraggio degli odori.

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Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Qui si descrivono come ottimizzare l&#39;immagine video acquisiti per un olfattivo magnetico-legare (OMT) apparato. Ci descrivono anche due protocolli campione sperimentale per lo studio visuo-olfattiva fusione.

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Views.  University of California, Los Angeles. Qui si descrivono come ottimizzare l'immagine video acquisiti per un olfattivo magnetico-legare (OMT) apparato. Ci descrivono anche due protocolli campione sperimentale per lo studio visuo-olfattiva fusione.

Video: Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Ricerca

Biologia

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Un sistema magnetico Tether per Indagare visivo e olfattivo di controllo mediata Volo in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods Article

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila