Dieses Protokoll ermöglicht die Cellulo-Quantifizierung von DNA und die Resektion nach DNA-Schäden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Zellzyklusmarkierung, die die Zellen auf die S- und G2-Phase beschränkt und sicherstellt, dass das Bromodeoxyuridin-Signal aus DNA und Resektion resultiert. Das Verfahren wird von Jean-Yves Masson, einem leitenden Forscher, und Sofiane Y.Mersaoui, einem Postdoktoranden, demonstriert.
Arbeiten Sie unter einer sterilen Kulturhaube und legen Sie einen einzelnen Deckglas in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte für so viele Bedingungen wie nötig. Platte etwa 150.000 HeLa-Zellen zur Transfektion oder medikamentösen Behandlung. Am dritten Tag, nach der nächtlichen Inkubation mit BrdU in einer Endkonzentration von 10 Mikromol, bestrahlen Sie die Platten mit einer Gesamtdosis von fünf Grau der Röntgenbestrahlung.
Nach der Bestrahlung geben Sie die Platten zur Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlenoxid befeuchteten Inkubator für drei Stunden zurück. Zur Vorextraktion das Medium absaugen und die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS waschen. Nachdem Sie PBS entfernt haben, fügen Sie zwei Milliliter Vorextraktionspuffer A hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten auf Eis.
Nach 10 Minuten Puffer A aspirieren, zwei Milliliter Zytoskelett-Stripping-Puffer B hinzufügen und die Inkubation wiederholen. Dann vorsichtig Puffer B absaugen und die Zellen mit PBS waschen. Nach dem Absaugen von PBS fixieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter von 4% Paraformaldehyd unter die chemische Haube geben.
Nach dem Entfernen des Paraformaldehyds und dem Waschen mit PBS die Deckgläser mit 100% kaltem Methanol für die Inkubation bei minus 20 Grad Celsius für fünf Minuten abdecken und die Deckgläser zweimal mit PBS waschen. Zur Permeabilisierung inkubieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS, die 0,5% Tritan X-100 bei Raumtemperatur enthalten. Nach 15 Minuten waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern PBS.
Für die Immunfärbung fügen Sie jedem Bohrloch zwei Milliliter Blockierungspuffer hinzu. Nach einer Stunde Inkubation 100 Mikroliter primäre Antikörperlösung zu jedem Deckglas geben. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser mit quadratischem Parafilm abzudecken, und positionieren Sie den Parafilm sorgfältig, um keine Blasen zu erzeugen.
Dann die Platte mit Aluminiumfolie abdecken und den primären Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag die Parafilmquadrate und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern PBS. Nach dem Waschen werden 100 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung auf jeden Deckglas gegeben und die Deckgläser wie gezeigt mit einem Quadrat Parafilm bedeckt.
Inkubieren Sie den Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde und schützen Sie die Platte mit Folie vor Licht. Anschließend waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern 1X PBS. Für die Kernfärbung fügen Sie zwei Milliliter DAPI-Lösung zu jedem Deckglas hinzu und waschen Sie die Deckgläser mit PBS.
Fügen Sie 10 bis 20 Mikroliter ZF-spezifisches Montagemedium auf Objektträger hinzu. Verwenden Sie die Nadel oder eine feine Pinzette, um den Deckglas vom Boden des Brunnens zu heben. Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab, indem Sie eine Kante vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen und die Deckgläser auf Objektträger montieren.
Importieren Sie diese Dateien zur Bilderfassung und -analyse in CellProfiler und analysieren Sie sie mithilfe der Speckle-Zählpipeline. Identifizieren Sie das primäre Objekt, um die Herde anhand der im Textmanuskript beschriebenen Einstellungen zu identifizieren und die Intensität zu messen. Repräsentative Bilder der Bildung von 5-Brom-2-prime-Desoxyuridin-Herden und der proliferierenden Zellkernantigenfärbung nach Bestrahlung sind hier gezeigt.
Die erzeugten einzelsträngigen DNA-Spuren wurden als unterschiedliche Herde visualisiert. Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der Bromodeoxyuridin-Färbung in den Kernen exprimiert. Die Co-Färbung zeigte eine Differenzierung zwischen der Kurzstreckenresektion aufgrund einer nicht-homologen Endverbindung und der Langstreckenresektion der homologen Rekombination unter Verwendung eines Anti-PCNA-Antikörpers zur Identifizierung von Zellen, die die S-Phase durchlaufen.
PCNA ist im Zellkern prominent und erreicht die maximale Expression während der S-Phase des Zellzyklus mit einer ziemlich intensiven Färbung. Das Ergebnis in Werten wird dann als Streudiagramm dargestellt, um zwischen PCNA-positiven und PCNA-negativen Kernen zu unterscheiden. Die PCNA-negativen Ergebnisse werden aus dem Datensatz entfernt, um eine brdU-intensitätsbasierte Analyse aufgrund des niedrigen BRDU-Signals unabhängig von der Bedingung zu ermöglichen.
Die PCNA-negativen Kerne beherbergen eine basal integrierte Intensität von BrdU-Herden von 900 beliebigen Einheiten und dieser Wert erreicht 1.800 AE in PCNA-positiven Kernen. Unter der siRNA-Kontrollbedingung beträgt die integrierte Intensität der BrdU-Herde pro Zellkern etwa 1.500 AE in den PCNA-positiven Kernen. Nach einem effizienten Knockdown von PARP-1 unter Verwendung einer siRNA wurde ein signifikanter Anstieg der Intensität der BrdU-Herde auf etwa 1.900 AE beobachtet.
Diese Technik kann wichtige Einblicke in die erste Stufe der homologen Rekombination liefern und so helfen zu erkennen, ob ein Protein am ersten Schritt des Reparaturweges beteiligt ist. Die Inkubationszeit für die Vorextraktionspuffer muss strikt eingehalten werden. Eine übermäßige Exposition gegenüber diesen Puffern führt zu einer übermäßigen Zellablösung und einem erhöhten Hintergrundsignal.
