Nach dem Autoklavieren von zwei Silikonplatten werden die Platten unter sterilen Bedingungen aus dem Autoklavenbeutel entnommen und in 150-Millimeter-Platten gelegt. Geben Sie 400 Mikroliter Fibronektinlösung in jede Vertiefung der Silikonplatten. Als nächstes werden die Skleraxis-positiv induzierten mesenchymalen Stromazellen im MSC-Medium resuspendiert und die lebensfähigen Zellen mit einem automatisierten Zellzähler gezählt.
Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das erforderlich ist, um 1,25 mal 10 bis die vierte Zelle pro Quadratzentimeter zu erhalten. Entfernen Sie dieses Volumen des MSC-Stretchmediums aus dem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie das erforderliche Volumen der Suspension mit Skleraxis-positiv induzierten mesenchymalen Stromazellen hinzu. Drehen Sie das Rohr um, um die Homogenität der neuen Zellsuspension zu gewährleisten.
Geben Sie 400 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung beider Silikonplatten. Setzen Sie den Deckel wieder auf die 150-Millimeter-Platten und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Bei einachsiger Spannung wird der Streckapparat mit doppelt destilliertem Wasser und anschließend mit 70%igem Ethanol gespült.
Wischen Sie das Gerät ab, legen Sie es in die Zellkulturhaube und setzen Sie es 15 Minuten lang ultraviolettem Licht aus. Als nächstes legen Sie eine Platte als statische Kontrolle in den Inkubator. Legen Sie die zweite sitzende Silikonplatte in den Streckapparat, indem Sie die Schrauben an den Löchern in der Silikonplatte ausrichten.
Setzen Sie dann den Deckel auf das Gerät. Befestigen Sie das Gerät mit der sitzenden Silikonplatte an der elektronischen Quelle und stellen Sie es bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Stellen Sie das zyklische Dehnungsprogramm für zwei Stunden pro Tag auf 4 % sinusförmige Dehnung in 0,5 Hertz ein.
Initiieren Sie das Dehnen, indem Sie den Startknopf drücken. Bei mechanischer Belastung von Skleraxis-positiv induzierten mesenchymalen Stromazellen führten zu hohe Aussaatdichten zu vorzeitiger Zellkontraktion und frühem Zelltod. Nach mehrtägiger Dehnung wurde in der gestreckten Gruppe der Skleraxis-positiv induzierten mesenchymalen Stromazellen ein gewisser Grad an Zellorganisation beobachtet, verglichen mit der zufälligen Zellorganisation in der statischen Gruppe.
Die Phalloidin-Färbung der Aktonfilamente zeigte, dass die Zellen senkrecht zur Streckrichtung wuchsen, im Gegensatz zu der zufälligen Zellorganisation, die in den statischen Platten beobachtet wurde. Die Genexpressionsanalyse ergab eine signifikante Hochregulierung der tenogenen Gene sowohl nach drei als auch nach sieben Tagen, verglichen mit nur den IMSCs am Tag Null. Die Kollagenablagerung in den Medien nach siebentägiger Dehnung war in der gestreckten Gruppe der skleraxis-positiv induzierten mesenchymalen Stromazellen signifikant höher als in allen anderen Gruppen.
