Zu Beginn transformieren Sie die Zellkultur von Agrobacterium tumefaciens auf selektive, mit Antibiotika ergänzte Hefe-Mannitol-Agar-Platten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem stehenden Inkubator. Am nächsten Tag die Kolonien aus der Kultur mit 12,5 Millilitern Hefe-Mannitol-Luria-Bertani-Brühe impfen und 16 Stunden lang bei 250 U/min auf einem Orbitalschüttler bei 28 Grad Celsius inkubieren.
12,5 Milliliter des Agrobacterium-Stammes LBA4404 in 112,5 Milliliter Hefe-Mannitol-Brühe mit Antibiotika impfen. Inkubieren Sie die Kultur auf einem Orbitalschüttler bei 28 Grad Celsius für 16 Stunden bei 250 U/min. Stellen Sie die Übernachtkultur mit der Kulturbrühe auf eine optische Dichte von 0,4 ein.
Fügen Sie dann vor der Inkubation 20 Mikromolaren Acetosyringon hinzu. Sobald die inkubierte Kultur eine optische Dichte von eins erreicht hat, zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet in Suspensionslösung auf eine optische Dichte von 0,6 und fügen Sie vor der Inkubation 200 mikromolares Acetosyringon hinzu.
Für die Agroinfiltration pflücken Sie holzige Kakaopflanzen mit Zweigen mit Blättern. Geben Sie 250 mikromolare Jasmonsäure in die Agrobacterium-Suspension. Als nächstes richten Sie einen Exsikkator mit einem Vakuummeter als Vakuumkammer ein, um den Druck im Inneren zu messen.
Legen Sie einen Biegering an, damit der Pflanzenzweig hindurchpasst. Legen Sie das Becherglas mit der Agrobacterium-Kultur in den Exsikkator und legen Sie den Zweig zwischen den Exsikkator und seinen Deckel, wobei die gewünschten Blätter in die Agrobacterium-Kultur getaucht werden. Verwenden Sie als Nächstes Silikonabformmaterial, um die Lücken zwischen Biegering, Pflanzenzweig und Exsikkator abzudichten.
Sobald das Silikonmaterial polymerisiert ist, schließen Sie den Exsikkator lückenlos und schließen Sie ihn dann an die Vakuumpumpe an. Starten Sie die Vakuumpumpe, bis sie minus 0,07 Megapascal erreicht. Wenn der gewünschte Druck erreicht ist, schließen Sie das Druckventil und schalten Sie die Pumpe aus, um den Druck fünf Minuten lang aufrechtzuerhalten.
Öffnen Sie das Druckventil allmählich und gleichmäßig, um den Kammerdruck wiederherzustellen. Nachdem Sie die Infiltration noch zweimal wiederholt haben, nehmen Sie den Zweig von der Zellsuspension. Reinigen Sie die infiltrierten Blätter mit destilliertem Wasser und stellen Sie die Pflanzen dann 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius in die Dunkelheit.
Setzen Sie das infiltrierte Gewebe nach der Inkubation einer 16-stündigen hellen und acht Stunden dunklen Fotoperiode aus. Infiltrierte Blätter der Pflanzen erscheinen an bestimmten Stellen dunkler, was auf das Eindringen von Agrobacterium hinweist. Das verwendete Reportersystem erzeugte eine Betalain-Anreicherung auf den Blättern, die mit bloßem Auge leicht als leuchtend rote Pigmentierung beobachtet werden kann.
Es wurde beobachtet, dass die Betalain-Akkumulation mit der Lebensfähigkeit des Gewebes variiert.
