Wir danken Jiří Macas (Biologiezentrum CAS, České Budějovice, Tschechische Republik) für die Bereitstellung des agrobakteriellen Stammes. Die Core Facility Plants Sciences der CEITEC MU ist für ihre technische Unterstützung bekannt. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik mit dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung, dem Projekt "SINGING PLANT" (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) und das Projekt INTER-COST LTC20004.

Agrobacterium-vermittelte Induktion und Regeneration behaarter Wurzeln bei Pflanzen

<ol>
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I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Wir haben ein einfaches Protokoll für die Transformation der Haarwurzel und die anschließende Regeneration bei B. napus und A. thaliana entwickelt. Dieser Prozess umfasst die Induktion der Haarwurzel auf Injektionsbasis im Hypokotyl (B. napus) oder im primären Blütenstandsstamm (A. thaliana). Die Methode der Injektion des Hypokotyls mit dem agrobakteriellen Stamm C58C1, der ein Ri-Plasmid trägt, war neben den in dieser Studie vorgestellten Mitgliedern der Brassicaceae auch in der Familie der Fabaceae10,11 wirksam.
Eine Alternative zur injektionsbasierten Methode ist die immersionsbasierte Transformation, die aus dem Eintauchen der Explantat in eine Bakteriensuspension und der anschließenden Co-Kultivierung des Explantats mit Agrobakterien besteht. Der Vorteil der Injektionsmethode gegenüber der Immersionsmethode ist die Zeitersparnis durch den Wegfall einiger Protokollschritte: Explantationsvorbereitung, Test der Co-Kultivierungszeit und Kultur auf einem hormonhaltigen Medium zur Induktion von Haarwurzeln. Obwohl beide Ansätze bei der Induktion von Haarwurzeln wirksam sind, wurde bei einigen Arten mit der injektionsbasierten Methode eine höhere Transformationseffizienz im Vergleich zur Explantat-Immersionsmethode beobachtet12,13. Darüber hinaus ist die injektionsbasierte Transformation auch für die Erzeugung von Korbpflanzen (transgene Haarwurzeln und Wildtyp-Triebe) nützlich. Nach dem Abschneiden der ursprünglichen Wurzeln der transformierten Pflanze unterstützen behaarte Wurzeln das Pflanzenwachstum, und das Transgen kann im Kontext der gesamten Pflanze untersucht werden.
Der kritische Schritt der Haarwurzelinduktion ist die Injektion des Inokulums in das Hypokotyl oder den primären Blütenstandsstamm. Die Hypokotyle von B. napus sind zerbrechlich, und das Schneiden des gesamten Hypokotyls kann leicht passieren. Das Gleiche kann bei A. thaliana aufgrund der Dünnheit des Blütenstandstamms beobachtet werden. Wenn ein Vergleich der Transformationseffizienz verschiedener Arten/Sorten erforderlich ist, empfehlen wir, dass eine Person alle Experimente durchführt, um den Fehler zu vermeiden, der durch Manipulation und Geschick beim Injizieren der Pflanzen verursacht wird.
Wir haben ein wirksames Protokoll für die Regeneration von Haarwurzeln in B. napus DH12075 und A. thaliana Col-0 entwickelt. Da die Regeneration ein sehr variabler Prozess ist, können einige Protokolländerungen auf eine Art oder Sorte Ihrer Wahl angewendet werden. Zum Beispiel können die behaarten Wurzeltriebe durch ein anderes Auxin/Cytokinin-Verhältnis (1:1) in B. oleraceahervorgerufen werden 14. Alternativ kann Cytokinin Thidiazuron anstelle von BAP verwendet werden, wie im Fall von B. campestris Haarwurzeln15.
Mehrfache Insertionen der Ri-Plasmid-T-DNA in das Pflanzengenom stellen eine potenzielle Einschränkung des Transformations- und Regenerationssystems der Haarwurzel dar. In solchen Fällen werden nach einer Segregationsanalyse von T1-Sämlingen keine TL/TR-freien Pflanzen aus dem Ri-Plasmid entdeckt. Daher empfehlen wir, für jedes Transgen mehrere unabhängige Haarwurzellinien zu erzeugen.
Haarwurzelkulturen sind ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug für genfunktionelle Studien, vor allem wegen ihrer schnellen Etablierung und kostengünstigen Wartung (keine Hormone in Kulturmedien erforderlich). Dieses Protokoll umfasst die Methoden zur Induktion und Regeneration von Haarwurzeln bei B. napus und A. thaliana, die verwendet werden können, um das interessierende Transgen direkt in Haarwurzelkulturen, im Kontext der gesamten Pflanze unter Verwendung von Mischpflanzen oder nach der Regeneration der transgenen Pflanzen zu untersuchen.

Die Pflanzentransformation ist der Flaschenhals jeder genetischen Studie in der Pflanzenbiologie. Ein bodenbürtiges Bakterium, Agrobacterium tumefaciens, wird häufig als Mittel zur Genübertragung durch Blütendip oder Gewebekultur zur Erzeugung von Transformanten verwendet. A. tumefaciens infiziert Pflanzen an einer Wundstelle und verursacht Tumore durch die Übertragung und Integration von T-DNA von einem tumorinduzierenden (Ti) Plasmid in das Genom der Wirtspflanze. Modifizierte A. tumefaciens-Stämme mit modifiziertem Ti-Plasmid ohne Wildtyp-T-DNA und einem binären Vektor mit künstlicher T-DNA und Klonierungsstellen zum Einfügen eines Gens von Interesse werden üblicherweise als effizientes Pflanzentransformationssystemverwendet 1. Viele Modellarten und -kulturen sind jedoch resistent gegen Blütendip oder In-vitro-Pflanzenregeneration oder haben lange Wachstumszyklen, was sich auf die Effizienz dieses Transformationssystems auswirkt.
Agrobacterium rhizogenes induziert die Bildung von Adventivwurzeln oder Haarwurzeln an der Wundstelle nach der Infektion einer Wirtspflanze. Ähnlich wie A. tumefaciens überträgt A. rhizogenes eine T-DNA von einem wurzelinduzierenden (Ri) Plasmid auf das Genom der Wirtspflanze, was zur Entwicklung transgener Haarwurzeln führt. Dieser Prozess wird hauptsächlich durch die Gene der onkogenen Wurzelloci (rol)gesteuert 2,3. Unter Verwendung von Agrobakterienstämmen, die sowohl das Ri-Plasmid als auch einen künstlichen binären Vektor tragen, der für ein Gen von Interesse kodiert, wurden Haarwurzelkulturen verwendet, um rekombinante Proteine herzustellen, die Funktion von Promotoren oder Genen zu analysieren oder Genome mit Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-assoziiertem Protein 9 (Cas9)4,5,6 zu bearbeiten.
Unser Protokoll verwendet den transkonjuganten Stamm Ti-less A. tumefaciens C58C1, der das Ri-Plasmid pRiA4b7 trägt. Die T-DNA des Ri-Plasmids besteht aus zwei Regionen, der rechten und linken T-DNA (TR-DNA bzw. TL-DNA), die sich unabhängig voneinander in das Pflanzengenom integrieren können8. Unter Ausnutzung dieses Systems wurde der langwierige Explantat-Transformationsprozess in der Brassica napus DH12075-Sorte optimiert9. Das unten beschriebene Protokoll ermöglicht die Regeneration ausgewählter behaarter Wurzellinien und die Gewinnung von T1-Pflanzen, die das gewünschte Transgen tragen und frei von Rol-Genen sind, in etwa 1 Jahr. Die injektionsbasierte Haarwurzeltransformation kann bei anderen Brassicaceae-Arten angewendet werden, wie die Transformation von Arabidopsis thaliana Col-0 zeigt. Während Hypokotyl zur Transformation von B. napus verwendet wird, wird A. thaliana in den primären Blütenstandsstamm injiziert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

Die Haarwurzeltransformation stellt ein vielseitiges Werkzeug für die Pflanzenbiotechnologie bei verschiedenen Arten dar. Die Infektion mit einem Agrobacterium-Stamm , der ein wurzelinduzierendes (Ri) Plasmid trägt, induziert die Bildung von Haarwurzeln an der Wundstelle nach dem Transfer von T-DNA aus dem Ri-Plasmid in das Pflanzengenom. Das Protokoll beschreibt detailliert das Verfahren der injektionsbasierten Haarwurzelinduktion bei Brassica napus DH12075 und Arabidopsis thaliana Col-0. Die Haarwurzeln können verwendet werden, um ein Transgen von Interesse zu analysieren oder für die Erzeugung transgener Pflanzen zu verarbeiten. Regenerationsmedium, das Cytokinin 6-Benzylaminopurin (5 mg/L) und Auxin-1-Naphthalinessigsäure (8 mg/L) enthält, löst bei beiden Spezies erfolgreich die Sprossbildung aus. Das Protokoll umfasst die Genotypisierung und Auswahl von Regeneriermitteln und T1-Pflanzen, um Pflanzen zu erhalten, die ein Transgen von Interesse tragen und frei von T-DNA aus dem Ri-Plasmid sind. Ein alternativer Prozess, der zur Bildung einer Verbundanlage führt, wird ebenfalls dargestellt. In diesem Fall werden behaarte Wurzeln am Spross (anstelle der natürlichen Wurzeln) belassen, was die Untersuchung eines Transgens in behaarten Wurzelkulturen im Kontext der gesamten Pflanze ermöglicht.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Autor im Rampenlicht: Optimierung von haarwurzelbasierten Transformationsprotokollen für eine höhere Effizienz bei Brassicaceae

Haarwurzeltransformation und -regeneration bei Arabidopsis thaliana und Brassica napus

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

Wir haben zuvor ein Protokoll für die injektionsbasierte Haarwurzelinduktion bei drei Sorten von Brassica napus optimiert, nämlich DH12075, Topas DH4079 und Westar9. Um dieses Transformationsprotokoll auf die Modellart A. thaliana anzuwenden, wurden die primären Blütenstandsstämme von 1 Monat alten Pflänzchen mit einem agrobakteriellen Inokulum injiziert. Behaarte Wurzeln traten nach 2-4 Wochen an der Injektionsstelle auf. Behaarte Wurzeln wurden herausgeschnitten und auf dem festen Medium kultiviert. Der Vergleich der Methode bei diesen beiden Arten ist in Abbildung 1 dargestellt.
Ausgewählte behaarte Wurzellinien wurden auf das Regenerationsmedium übertragen, um die Sprossbildung zu induzieren. Bei A. thaliana wurden gelbe Calli innerhalb von 14 Tagen in allen 10 getesteten Haarwurzellinien induziert. Die ersten Sprossprimordien, die als dunkelgrüne Flecken sichtbar waren, entstanden innerhalb von 3 Wochen nach der Übertragung auf das Regenerationsmedium (Abbildung 2). Nach 4 Wochen Kultur bedeckten die Triebe die Haarwurzeln in 9 von 10 Haarwurzellinien (90% Regenerationseffizienz). In einigen Fällen wurden dem Kallus Adventivwurzeln entlockt (Abbildung 2H). Eine Linie regenerierte sich auch nach 3 Monaten auf dem Regenerationsmedium nicht (alle 4 Wochen wurden die Haarwurzeln in ein frisches Medium überführt). Somit ähnelt die Regenerationseffizienz von A. thaliana Haarwurzeln der Effizienz von B. napus DH120759.
Haarwurzelregeneriermittel von B. napus und A. thaliana weisen einen Zwergphänotyp auf (Abbildung 3), ein typisches Merkmal der aus der Haarwurzel stammenden Pflanzen2. Wir beobachteten auch dichte Wurzelsysteme, faltige Blätter und Veränderungen der Blütezeit. Dieser sogenannte Haarwurzel- (oder Ri-) Phänotyp wird durch die rol-Gene aus dem Ri-Plasmid verursacht, die in das Pflanzengenom eingefügt wurden. Die Insertion der Ri-T-DNA und des Transgens, das auf einem binären Vektor kodiert ist, kann unabhängig oder verknüpft sein. So hilft eine Segregationsanalyse von T1-Nachkommen, die durch Selbstbestäubung entstanden sind, rol-freie Pflanzen zu identifizieren, die das interessierende Transgen exprimieren. Die Genotypisierung der T1-Pflanzen erfolgt durch PCR-Primer, die spezifisch für die ORFs von TL und TR und das interessierende Transgen sind. Das Fehlen einer agrobakteriellen Kontamination wird durch das Fehlen von PCR-Produkten von virC-Primern bestätigt (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> Abbildung 1: Zusammenfassung des Verfahrens bei A. thaliana und B. napus. Die Injektion des Agrobacterium-Inokulums in den Hypokotyl- oder primären Blütenstandsstamm induziert die Entwicklung von Haarwurzeln. Die behaarten Wurzeln können die einheimischen Wurzeln ersetzen, um eine zusammengesetzte Pflanze zu erzeugen, die genotypisiert und analysiert wird (blaue Pfeile). Kultivierte Haarwurzeln können zu T0-Pflanzen regeneriert, in T1-Pflanzen vermehrt und genotypisiert werden (grüne Pfeile). Die behaarten Wurzeln können auch für die Funktionsanalyse subkultiviert werden (schwarzer Pfeil). Beispiele für Genotypisierungsergebnisse werden vorgestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> Abbildung 2: Regeneration der Haarwurzeln in A. thaliana. (A) Haarwurzelkultur 1 Tag nach der Übertragung auf die Platten. (B, C) Calli entwickelte sich innerhalb von 2 Wochen nach der Kultur auf Regenerationsmedium. (D, E) Triebprimordien entstanden nach 3 Wochen Kultur. (G, H) Die Triebe bilden sich nach 4 Wochen. (H) Adventivwurzeln, die sich aus dem Kallus entwickelt haben. (C, F, I) Nicht regenerierende Haarwurzellinie. Maßstabsleisten stellen 1 cm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Fotos von B . napus - und A. thaliana-Wildtyp-Pflanzen und aus Haarwurzeln gewonnenen Regenerierzien (T0-Pflanzen). Beachten Sie den Ri-Phänotyp der Regeneriermittel. Die Maßstabsbalken stellen 2 cm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Das Protokoll beschreibt die Induktion der Haarwurzel unter Verwendung von primären Arabidopsis-Blütenstandsstämmen und Brassica napus-Hypokotylen . Die Haarwurzeln können kultiviert und als Explantate zur Regeneration transgener Pflanzen verwendet werden.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Unsere Forschung zielte darauf ab, ein Protokoll für eine effiziente Transformation in Brassicaceae zu entwickeln. Mit einer auf Haarwurzeln basierenden Transformation haben wir die Transformationseffizienz von Brassica napus dramatisch verbessert, was für unsere Forschung von entscheidender Bedeutung ist. Wir haben das Protokoll auch an der Modellart Arabidopsis thaliana getestet.Wir haben das Protokoll für Frühjahrssorten optimiert, die in Brassica napus DH12075. Die nächste Herausforderung besteht darin, das Protokoll der Transformation und Regeneration von Wintersorten in Brassica napus sowie in Brassica rapa und Brassica oleracea zu optimieren. Behaarte Wurzeln können leicht vermehrt werden, und ihr schnelles Wachstum ermöglicht die sofortige Analyse des interessierenden Gens kurz nach der Transformation.Folglich wird es möglich, bestimmte Haarwurzellinien, die das gewünschte Merkmal aufweisen, selektiv zu regenerieren. Zum Beispiel eine Genmutation, die durch CRISPR-Cas eingeführt wurde.

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Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.0K Aufrufe.  Masaryk University. Unsere Forschung zielte darauf ab, ein Protokoll für eine effiziente Transformation in Brassicaceae zu entwickeln. Mit einer auf Haarwurzeln basierenden Transformation haben wir die Transformationseffizienz von Brassica napus dramatisch verbessert, was für unsere Forschung von entscheidender Bedeutung ist. Wir haben das Protokoll auch an der Modellart Arabidopsis thaliana getestet.Wir haben das Protokoll für Frühjahrssorten optimiert, die in Brassica napus DH12075. Die nächste Her...

Serie: Autor im Rampenlicht: Optimierung von haarwurzelbasierten Transformationsprotokollen für eine höhere Effizienz bei Brassicaceae

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Forschung

Biologie

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

Agrobacterium-vermittelte Haarwurzeltransformation in Brassica napus DH12075

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

Regenerations- und Selektionsmethoden für Brassica napus DH12075 Regenerierantien und T1-Pflanzen

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.