Lösen Sie zunächst zwei Milligramm multivalentes PEG mit Maleimid-reaktiver Gruppe und einen Milliliter 100-Millimol-Phosphatpuffer auf. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter. Fügen Sie der Lösung die Cystein-terminierten DNA-Peptid-Konjugate hinzu.
Verwenden Sie die Größenausschlusschromatographie, um die nicht konjugierten Materialien zu entfernen. Führen Sie die Beispiele in PBS aus. Überwachen Sie die Absorption der zum Nachweis von DNA und Peptiden.
Geben Sie die Probe in die Zentrifugalfilterröhrchen und konzentrieren Sie die synthetisierten Nanosensoren durch Zentrifugation gemäß der vom Hersteller empfohlenen Geschwindigkeit. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte als Basis für eine kundenspezifische Gehäusekammer. Um den Urin für Basismessungen zu sammeln, legen Sie zuerst eine Maus in die Gehäusekammer.
Üben Sie sanften Druck auf die Blase der gefesselten Maus aus, um den verbleibenden Urin auf die Platte auszustoßen. Pipettieren Sie den gesammelten Urin in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Bereiten Sie 200 Mikroliter der Nanosensor-Injektionslösung in sterilem PBS vor.
Injizieren Sie intravenös 200 Mikroliter der Lösung in jede Maus. Sammeln Sie nach einer Stunde Injektion die Urinproben von den Kontroll- und Versuchsmäusen. Für die fluoreszenzbasierte CRISPR-Detektion der DNA-Barcodes zentrifugieren Sie die Urinproben bei 800 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Kombinieren Sie nun die CRISPR-Reagenzien, fügen Sie dann das Cas12a-Enzym hinzu, bevor Sie das Reaktionsgemisch vorsichtig auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie dann die Reporterreaktion mit der FRET-basierten Reporter-DNA-Mischung durch.
Geben Sie die Mischung in eine 384-Well-Platte und messen Sie sofort die Fluoreszenz bei 37 Grad Celsius alle zwei Minuten für drei Stunden, um die Spaltkinetik zu überwachen. Um einen papierbasierten CRISPR-Nachweis durchzuführen, führen Sie nach der Inkubation der CRISPR-Reaktion eine alternative Reporterreaktion mit einem FAM-Biotin-markierten DNA-Reporter durch. Nachdem Sie die Reagenzien zu einer 96-Well-Platte kombiniert haben, decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab und legen Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator.
Geben Sie nun 80 Mikroliter PBS in eine frische Vertiefung einer 96-Well-Platte. Pipettieren Sie 20 Mikroliter Reporterreaktionsgemisch in diese Vertiefung. Legen Sie einen Lateral-Flow-Papierstreifen in jede Vertiefung und warten Sie, bis die Flüssigkeit die Oberseite des Streifens erreicht.
Die chemisch modifizierte einzelsträngige DNA zeigte eine Cas12a-Aktivierung im Vergleich zur unmodifizierten doppelsträngigen DNA und der einzelsträngigen DNA. Modifizierte DNA-Moleküle im unverarbeiteten Urin zeigten eine kolorimetrische Auslesung auf Lateral-Flow-Papierstreifen. Die führende Probenbande zeigte die Freisetzung von nachweisbarem FAM durch die durch Harn-DNA ausgelöste Reporterspaltung an.
