Unser Protokoll bietet einen vereinfachten Workflow für streptomyces venezuelae zellfreie Transkriptionsübersetzung. Unser System nutzt die Stoffwechselenzyme und -wege dieses Nicht-Modellorganismus. Die Hauptvorteile sind die heterologe Expression von Genen mit hohem GC-Gehalt, die Bereitstellung einer günstigen Proteinweiterleitungsumgebung und ein offenes System zur Feinabstimmung von Biosynthesewegen.
Unsere Methode wird neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Streptomyces und verwandten Bakterien mit hohem GC eröffnen. Es ermöglicht die Untersuchung von Enzymen und Genexpression in diesen Bakterien. Diese Technik wurde entwickelt, um die Implementierung durch neue Benutzer zu erleichtern.
Der einzige Schritt, der vorherige Erfahrung oder Eingewöhnung erfordert, ist die Beschallung, um hochaktive Rohextrakte herzustellen. Um am dritten Tag mit der Ernte der vorkultivierten Zellen zu beginnen, verdünnen Sie die Nachtkultur im Verhältnis eins zu 10 mit einem frischen GYN-Medium für die optische Dichte- oder OD-Messung bei 600 Nanometern. Wenn der OD der Kultur bei 600 Nanometern weniger als 0,3 beträgt, erhöhen Sie die Schüttelgeschwindigkeit auf 250 bis 300 Umdrehungen pro Minute und wachsen Sie, bis ein OD 0,3 erreicht.
Wachsen Sie nicht länger als zwei Weitere Stunden. Wenn der OD größer als 0,3 ist, die Kulturen in Zentrifugationsbehälter geben und 30 Minuten lang schnell auf Nassemis abkühlen. Während Sie darauf warten, dass die Zellkultur abkühlt, bereiten Sie vier Milliliter frische einmolare Dithiothreitol-, S30A- und S30B-Puffer vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.
Nach dem Wiegen eines leeren 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchens bei minus 20 Grad Celsius vorkühlen. Fügen Sie zwei Milliliter eines molaren Dithiothreitol zu einem Liter S30A-Puffer auf Eis hinzu und mischen Sie gut. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nachdem Sie den Überstand in einer schnellen Bewegung verworfen haben, fügen Sie 250 Milliliter S30A-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die Zentrifugationsflaschen kräftig schütteln, bis die Zellklumpen homogen verteilt sind. Dann zentrifugieren Sie die Zellen erneut für sechs Minuten. Verwerfen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und wiederholen Sie die Zugabe des S30A-Puffers, gefolgt von der Zentrifugation wie gezeigt.
Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter eines molaren DTT zu einem Liter S30B-Puffer auf Eis hinzu und mischen Sie gut. Fügen Sie den Zellen 250 Milliliter S30B-Puffer hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter S30B-Puffer und übertragen Sie die Zellsuspension in das vorgewogene vorgekühlte 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Bei Bedarf werden die Restzellen mit weiteren fünf bis 10 Millilitern S30B-Puffer versetzt und das Röhrchen auf 50 Milliliter Volumen mit S30B gefüllt. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Zentrifugation bei den vorherigen Einstellungen wie demonstriert.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, saugen Sie den verbleibenden S30B-Überstand mit einer 100 bis 200 Mikroliter pipette ab und wiegen Sie das Nasszellpellet. Für jedes Gramm Nasszellen werden 0,9 Milliliter S30B-Puffer hinzugefügt. Resuspendieren Sie die Zellen entweder mit einer Pasteurpipette oder einem Wirbel.
Zentrifugieren Sie kurz für ca. 10 Sekunden bis zu 500 G, um die Zellen zu sedimentieren. Senken Sie die Ultraschallspitze in die Zellsuspension, bis sich die Spitze etwa einen Zentimeter unter der Flüssigkeitsoberfläche befindet. Geben Sie verschiedene Parameter in die Sonicator-Einstellungen ein.
Stellen Sie die Frequenz auf 20 Kilohertz, die Amplitude auf 65% Puls-Ein- und Ausschaltzeit auf 10 Sekunden und die Gesamtschallationszeit auf eine Minute ein. Beginnen Sie mit der Beschallung und bewegen Sie die Röhre während der ersten beiden Ruhezyklen nach oben oder unten und zur Seite, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig beschallt sind. Wenn die Zellen nicht vollständig lysiert sind, kehren Sie die Röhre zwei- bis dreimal um und wiederholen Sie die Beschallung für weitere ein oder zwei 10-Sekunden-Zyklen mit häufigem Mischen, bis die Zellen vollständig gestört sind.
Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen, um die Zelltrümmer zu entfernen, und übertragen Sie den Überstand dann in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen als ein Milliliter Aliquot. Für die Abflussreaktion der Zellextrakte inkubieren Sie die Zellextrakt enthaltende Zelle bei 30 Grad Celsius für 60 Minuten auf einem Wärmeblock oder im Inkubator ohne Shaker. Für die Transkriptions-Translations-Reaktion den Zellextrakt SMM oder mes-Lösung und die Plasmid-DNA auf Eis auftauen.
Kühlen Sie eine 384-Well-Platte bei minus 20 Grad Celsius vor. Richten Sie die Transkriptions-Translationsreaktion auf dem Eis ein, wobei 25% des Volumens Plasmid-DNA, 33,33% Zellextrakt und 41,67% SMM-Lösung sind. Wirbeln Sie die Mischung vorsichtig für etwa fünf Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist und gleichzeitig Schaumbildung oder Blasenbildung vermieden wird.
Drei Aliquots von 10 Mikrolitern in drei Vertiefungen einer 384-Well-Platte als technisches Dreifaches überführen, ohne Luftblasen einzuführen. Nachdem Sie die Platte mit einer transparenten Abdeckung versiegelt haben, drehen Sie die Platte fünf Sekunden lang bei 400 mal G und inkubieren Sie die Reaktion bei 28 Grad Celsius entweder in einem Inkubator oder einem Plattenleser ohne zu schütteln. Streptomyces venezuelae zellfreie Transkriptionstranslation wurde für die hochentwertige Expression von fluoreszierenden Proteinen aus dem Standardplasmid pTU1-A-SP44 sowie für biosynthetische Enzyme, die durch Gelelektrophorese nachgewiesen wurden, optimiert.
Die Expression des Standardplasmids pTU1-A-SP44-mScarlet-I wurde mit mehreren Methoden gemessen. Die Echtzeit-Fluoreszenzmessungen von mRNA mit dem dBroccoli-RNA-Aptamer, dem unreifen mScarlet-I-Protein mit dem FlAsH-Tag-System und dem reifen mScarlet-I-Protein wurden durchgeführt. Die In-Gel-Fluoreszenzfärbung von mScarlet-I unter Verwendung des FlAsH-Tags wurde zusätzlich zur Coomassie Blue-Färbung des gesamten zellfreien Proteins durchgeführt.
Nach diesem Verfahren können Aktivitätsassays durchgeführt werden, um Enzyme und Signalwege zu untersuchen, die mit Standardmethoden eine Herausforderung darstellen. Es erstreckt sich auch auf eine skalierte Biosynthese und eine Hochdurchsatz-Genexpression. Wir entwickeln diese Technik, um Stoffwechselenzyme aus Bakterien mit hohem GC-Gehalt zu untersuchen.
Wir haben das Potenzial unseres Systems gezeigt, die skalierte Biosynthese in zellfreien Reaktionen zu untersuchen.
