Für jede Probe einen Milliliter LB-Bouillon und eine LB plus Gentamicin-Agarplatte vorwärmen und in einem auf 37 Grad Celsius eingestellten statischen Inkubator kontrollieren. In einem kombinierten Volumen von fünf Mikrolitern oder weniger werden jeweils 100 bis 200 Nanogramm des pTNS2-Helferplasmids und des pUC18-Tmini-Tn7-Tlac-Gentamicin-adeIJK-Insertionsplasmids zu einem Aliquot elektrokompetenter Zellen hinzugefügt. Mischen Sie mit sanftem Fingertippen, um eine vollständige Vermischung der Plasmide mit den elektrokompetenten Zellen ohne Blasenbildung zu gewährleisten.
Ein äquivalentes Volumen sterilen destillierten Wassers in das Aliquot der Negativkontrollzelle geben und vorsichtig wie zuvor gezeigt mischen. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis. Übertragen Sie die gesamte Zellprobe in eine eiskalte Elektroporationsküvette und legen Sie die Küvette dann wieder auf Eis.
Um die Zellprobe zu elektropolieren, schalten Sie den Elektroporator ein und stellen Sie ihn auf zwei Kilovolt ein. Wischen Sie die Oberfläche der Küvette mit einem weichen Tuch ab, um anhaftendes Eis oder Feuchtigkeit zu entfernen. Führen Sie die Küvette in den Elektroporator ein und geben Sie den Stromschlag ab.
Geben Sie sofort 0,9 Milliliter vorgewärmte LB-Brühe zu den Zellen in der Küvette und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen mit dem Medium zu mischen. Die gesamte Zellsuspension wird bei Raumtemperatur in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen überführt. Überprüfen Sie dann den Zeitkonstantenwert am Elektroporator.
Für beste Ergebnisse sollte dieser Wert zwischen vier und sechs liegen. Inkubieren Sie die elektroporierten Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius bei 250 U/min, um eine Zellrückgewinnung zu ermöglichen. Verteilen Sie nach einer Stunde 100 Mikroliter jeder Probe mit einem Impfstreuer auf einer vorgewärmten LB plus Gentamicin-Agar-Platte.
Inkubieren Sie die Platten 16 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Elektroporationsplatten. Entnehmen Sie mit sterilen Zahnstochern bis zu 10 Einzelkolonien von den LB plus Gentamicin-Agar-Platten und flicken Sie sie auf eine frische LB plus Gentamicin-Agar-Platte.
Inkubieren Sie die Platten 16 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Das Patchen von Transformationsplattenkolonien auf selektive Medien konserviert den transformierten Stamm und liefert Ausgangsmaterial für das Kolonie-PCR-Screening. Das PCR-Produkt für die Screening-Primer, ABglmS2 forward new und Tn7 reverse, besteht aus 382 Basenpaaren.
Zu den Negativkontrollen für die Reaktion gehören der Wildtyp A.baumannii ATCC 17978, AB 258 und kein Template.
