Zu Beginn resuspendieren Sie die aus dem Knochenmark abgeleiteten Makrophagen von Neugeborenen der Maus in vollständigem DMEM ohne Phenolrot oder Antibiotika. 500 Mikroliter Zellsuspension mit einer Dichte von 200.000 pro Quadranten in einer 35-Millimeter-Quad-Schale aussäen. Entfernen Sie den vorberechneten Bestand an Escherichia coli ab minus 80 Grad Celsius.
Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen der Zellsuspension in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um ein bakterielles Inokulum bei einer Infektionsvielfalt von 25 herzustellen, und fügen Sie dann PBS zu einem Gesamtvolumen von einem Milliliter hinzu. Die Bakteriensuspension wird fünf Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert und das Pellet in 50 Mikrolitern PBS resuspendiert. Geben Sie grünen fluoreszierenden pH-empfindlichen Farbstoff zu einer Endkonzentration von 500 Mikromolaren hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang im Dunkeln für die Farbstoffkonjugation.
Waschen Sie die Bakterien viermal mit einem Milliliter PBS durch Zentrifugation bei 1000 G für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern vollständigem DMEM ohne Phenolrot und fügen Sie die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagenkulturen hinzu. Inkubieren Sie die Kultur vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Fügen Sie 200 Nanogramm zelldurchlässigen roten Fluoreszenzfarbstoff hinzu, um die Lysosomen zu färben. Bei einer bakteriellen Infektion wurden reichlich grün fluoreszierende Bakterien nachgewiesen, die in aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen phagozytiert wurden. Die grüne Fluoreszenz lokalisiert sich weiter, wobei die rote Fluoreszenz auf angesäuerte Lysosomen hinweist. Die Phagozytose und das Auftreten von grünen, pH-sensitiven dipositiven Makrophagen aus dem Knochenmark von Neugeborenen wurden ebenfalls während der vierstündigen Infektion beobachtet.
