Um eine Einzelzellsuspension aus dem isolierten Neuronengehirn zu erhalten, legen Sie das Gehirn in einen vorgekühlten 15-Milliliter-Glas-Dounce-Homogenisator, der eine angemessene Menge eiskalter Hanks'balancierter Salzlösung oder HBSS-Puffer enthält. Verwenden Sie den losen Dounce Stößel, um das Hirngewebe mit etwa 100 bis 120 Schlägen auf Eis sanft und langsam zu dissoziieren. Filtrieren Sie die resultierende Hirngewebesuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Spülen Sie das Dounce-Röhrchen mit fünf Millilitern HBSS und fahren Sie mit der Filtration fort, um die Zellentnahme zu maximieren. Die filtrierte Gewebesuspension bei 550 g sechs Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuumsauger und resuspendieren Sie den Zellgaumen in einem Milliliter einer 30%igen isotonischen Dichtegradientenlösung.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine angemessene Menge einer 30%igen Dichtegradientenlösung hinzu und drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie das Röhrchen sofort bei 845 g mit Beschleunigung und Bremse auf Stufe drei für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge, ohne es zu schütteln, und saugen Sie die obere Myelinschicht vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Spitze ab, die mit dem Vakuum verbunden ist. Aspirieren Sie dann den Überstand, lassen Sie ein bis zwei Milliliter zurück und resuspendieren Sie den Zellgaumen mit mindestens 10 Millilitern kaltem HBSS. Bei 550 g sechs Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Waschen Sie noch einmal mit mindestens sieben Millilitern kaltem HBSS und zentrifugieren Sie erneut. Nachdem Sie so viel Überstand wie möglich entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellen in 100 bis 200 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer für die Durchflusszytometrieanalyse.
