Bereiten Sie zunächst eine befeuchtete Kammer vor, indem Sie eine große Objektträgerbox nehmen und die am Deckel haftende Kartonabdeckung entfernen. Legen Sie feuchte Papiertücher senkrecht an den Boden der Schiebebox und achten Sie darauf, dass sie flach liegen. Bereiten Sie den Objektträger für die Färbung durch Entparaffinisierung, Rehydratisierung, Antigengewinnung und Waschen vor.
Entfernen Sie den Objektträger von PBS und wischen Sie überschüssiges PBS ab, während Sie das Taschentuch vermeiden. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kasten um das Gewebe, um eine Barriere zu bilden. Lege die Konturfolie waagerecht über die feuchten Papiertücher.
Fügen Sie etwa 100 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu, um das Gewebe zu bedecken. Schließen Sie die Befeuchtungskammer und inkubieren Sie die Objektträger 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Klopfen Sie dann die Blockierungslösung vorsichtig ab.
Geben Sie sofort den vorbereiteten Maus-auf-Maus-Block hinzu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nehmen Sie am Ende der Inkubation die Objektträger aus der befeuchteten Kammer und legen Sie sie direkt in ein in PBS getauchtes Objektträgergestell. Entfernen Sie dann die Folien aus PBS.
Klopfen Sie das überschüssige PBS vorsichtig ab und legen Sie es waagerecht zurück in die befeuchtete Kammer. Fügen Sie entsprechend verdünnte Primärantikörper von Interesse hinzu, um das Gewebe zu bedecken. Sobald die Objektträger aus der befeuchteten Kammer entnommen wurden, klopfen Sie die primären Antikörper vorsichtig ab und legen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in ein Objektträgerrack, das in PBS getaucht ist.
Nachdem Sie die Objektträger aus PBS entnommen und überschüssiges PBS abgeklopft haben, legen Sie sie horizontal zurück in die befeuchtete Kammer. Fügen Sie entsprechend verdünnte Sekundärantikörper-Fluorophore oder konjugierte Primärantikörper von Interesse hinzu, um das Gewebe zu bedecken. Geben Sie dann entsprechend verdünntes Huist direkt auf das Gewebe, bevor Sie es bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
Legen Sie danach die Objektträger fünf Minuten lang im Dunkeln in eine neue, lösungsmittelbeständige Schale, die mit PBS gefüllt ist. Entfernen Sie jeweils eine Folie, und halten Sie die restlichen Folien im Dunkeln in PBS getaucht. Nachdem Sie überschüssiges PBS entfernt haben, geben Sie ein bis zwei Tropfen Antifading-Eindeckmittel in die Mitte des Gewebes.
Halten Sie einen sauberen Deckslip an den Rändern fest und senken Sie ihn langsam in einem Winkel von 45 Grad auf die Rutsche. Beginnen Sie in der Mitte des Taschentuchs und drücken Sie mit zwei Fingern vorsichtig auf den Deckglas. Befestigen Sie eine geschnittene, ungefilterte P200-Pipette an der Spitze einer serologischen Pipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist.
Entlang der Kanten des Deckglases das überschüssige Eindeckmedium mit dem Staubsauger entfernen. Legen Sie den Objektträger in einer neuen Objektträgerbox waagerecht flach hin, bevor Sie ihn im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen lassen. Mikroskopische Aufnahmen zeigten die Morphologie verschiedener Darmsegmente und die Färbung für Becherzellen.
Die apikale Membran, die laterale Membran der Epithelzellen und die Zellkerne. Die Immunfluoreszenzfärbung des Darms hob viele verschiedene zelluläre Kompartimente hervor, darunter proliferative Zellen, das Interstitium, die lysosomale Domäne und das Epithel.
