Per iniziare, prepara una camera umidificata prendendo una grande scatola di vetrini e rimuovendo il coperchio di cartone aderente al coperchio. Posiziona i tovaglioli di carta umidi verticalmente alla base della scatola di scorrimento, assicurandoti che siano piatti. Preparare il vetrino per la colorazione mediante deparaffinazione, reidratazione, recupero dell'antigene e lavaggio.
Rimuovere il vetrino dal PBS e rimuovere il PBS in eccesso evitando il fazzoletto. Con una penna idrofoba, disegna una scatola attorno al tessuto per formare una barriera. Posiziona lo scivolo di contorno orizzontalmente sui tovaglioli di carta umidi.
Aggiungere circa 100 microlitri di tampone bloccante per coprire il tessuto. Chiudere la camera umidificata e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 90 minuti. Quindi, picchiettare delicatamente la soluzione bloccante.
Aggiungere immediatamente il blocco topo su topo preparato per coprire il tessuto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere i vetrini dalla camera umidificata e posizionarli direttamente in un rack per vetrini immerso in PBS. Quindi, rimuovi le diapositive da PBS.
Picchiettare delicatamente il PBS in eccesso e riposizionarlo orizzontalmente nella camera umidificata. Aggiungere anticorpi primari di interesse opportunamente diluiti per coprire il tessuto. Una volta rimossi i vetrini dalla camera umidificata, picchiettare delicatamente gli anticorpi primari e posizionare i vetrini in un rack per vetrini immerso in PBS per cinque minuti.
Dopo aver rimosso i vetrini dal PBS e aver picchiettato il PBS in eccesso, riposizionarli orizzontalmente nella camera umidificata. Aggiungere fluorofori di anticorpi secondari opportunamente diluiti o anticorpi primari coniugati di interesse per coprire il tessuto. Quindi, aggiungere Huist opportunamente diluito direttamente sul tessuto prima di incubare a temperatura ambiente al buio.
Successivamente, posizionare i vetrini in un nuovo piatto resistente ai solventi riempito di PBS per cinque minuti al buio. Rimuovi una diapositiva alla volta, mantenendo le diapositive rimanenti immerse nel PBS al buio. Dopo aver rimosso il PBS in eccesso, aggiungere una o due gocce di mezzo di montaggio antisbiadimento al centro del tessuto.
Tenere un vetrino coprioggetti pulito per i bordi e abbassarlo lentamente sul vetrino con un angolo di 45 gradi. Partendo dal centro del fazzoletto, premere delicatamente sul vetrino coprioggetto con due dita. Collegare una pipetta P200 tagliata e non filtrata alla punta di una pipetta sierologica collegata a un vuoto.
Seguendo i bordi del vetrino coprioggetto, utilizzare l'aspirapolvere per rimuovere il supporto di montaggio in eccesso. In una nuova scatola di vetrini, stendere orizzontalmente il vetrino prima di lasciarlo asciugare al buio a temperatura ambiente. Le immagini microscopiche hanno mostrato la morfologia di diversi segmenti intestinali e la colorazione delle cellule caliciformi.
La membrana apicale, la membrana laterale delle cellule epiteliali e i nuclei. La colorazione immunofluorescente dell'intestino ha evidenziato molti compartimenti cellulari diversi, tra cui le cellule proliferative, l'interstizio, il dominio lisosomiale e l'epitelio.
