Wir möchten die Blelloch Labor zur Kommentierung des Textes danken. Diese Arbeit wurde vom Fonds zur RB von NIH (K08 NS48118 und R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (Seed Grants RS1-00161, New Faculty Award RN2-00906) und dem Pew Charitable Trust und FM aus den unterstützten Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

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	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

Alan Mir ist ein Mitarbeiter von Fluidigm Corporation. Ansonsten haben wir keine finanziellen Interessen offen zu legen.

miRNAs sind kurze (18-24 Nukleotide), nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression post-transkriptionell reguliert sowohl destabilisierende Boten-RNAs (mRNA) und hemmt deren Übersetzung. 6 Die Tatsache, dass mindestens ein Drittel der menschlichen Gene enthalten konservierte miRNA binding-sites in ihrer 3&#39;UTR und die offenkundige Wechselwirkungen von miRNAs mit Genen für Pluripotenz, Proliferation und Apoptose schlägt einen entscheidenden Beitrag in Zellschicksal Entscheidungen Gewebshomöostase und Krankheiten wie Krebs. 6,7 Deshalb genaue microRNA Expression Profile sind breiter Interesse. Um zu testen, die veröffentlichten Multiplex qRT-PCR miRNA Expression Profiling Protokoll 2 verwendeten wir kleine RNA-defizienten MESC als negative Kontrollen. DGCR8 - / - Zellen sind mangelhaft aller kanonischen microRNAs, während Dicer - / -. Zellen sowohl kanonischen und nicht-canoncial micoRNAs mangelnde 8,9 Vergleicht man Ebenen in Wildtyp-MES-bis DGCR8 - / - Zellen, entdeckten wir einen Mangel an Genauigkeit, da mehrere ausgedrückt 10 microRNAs nicht in den Wildtyp-Zellen 11 erkannt. Einige zeigten sogar niedriger Expression relativ zu den Knockout-Zellen (Abbildung 3a). Wir vermuten, dass der Mangel an Genauigkeit durch die massive Grundierung Übertrag der beiden aufeinanderfolgenden Schritte Multiplex (RT und Pre-PCR) vor Singleplex RT-Quantifizierung verursacht werden könnte. Allerdings ist Multiplex Vorverstärkung notwendig, um die Signalstärke zu verbessern, besonders am Anfang Konzentration der RNA begrenzt ist. / - - Durch Reinigung entfernt pre-PCR-Produkte von Primern nach Größe Auswahl an nativen Polyacrylamidgelen (Abbildung 2), konnten wir eine deutliche Verbesserung der Genauigkeit durch die Erkennung mehr microRNAs und einen Verlust von falsch-positiven Signale in beide DGCR8 demonstrieren und Dicer - / - Hintergründe (Abbildungen 3a und 3b) Neben der modifizierten qRT-PCR-Ansatz für die ordnungsgemäße Zuordnung von seltenen DGCR8 unabhängige / Dicer abhängig kleinen RNAs (Abbildung 3b) 11 erlaubt. Deshalb ist ein zusätzlicher Schritt, um übermäßige Primer vom Prä-PCR-Produkt zu reinigen ist eindeutig von Vorteil, vor allem, wenn große Multiplex-Primer-Sets pro Probe. Die optimale Anzahl der Vor-Amplifikationszyklen wird durch die Eingabe RNA-Konzentrationen bestimmt. Der Restbetrag nicht unter-oder overamplify sollte durch die Angabe der spezifischen Experiment geführt werden. Mit mehr als tausend bekannten microRNAs, von Standard-Einsatz 384-well Platten möglicherweise nicht optimal für ausgedehnte microRNA Profiling, insbesondere beim Vergleich mehrerer Proben. Die Fluidigm Dynamic Array IFC ermöglicht, mit einer signifikanten Abnahme der Pipettierschritte und brauchte Chemie-, Prüf-bis zu 96 einzelnen Proben gegen 96 verschiedene Mikro-RNAs in einem einzigen Experiment (9216 Reaktionen) bei Nanoliter-Maßstab (6,7 nL). Für jeden Lauf der Analyse-Software bietet Amplifikationskurven, farbkodierte Heat Maps und radeln Schwellenwerten (CT). Die gleichzeitige großen Profilierung reduziert experimentellen Abweichungen und ermöglicht bedeuten Ausdruck Normalisierung, die aus-führt andere Normalisierung Strategien, die Verwendung von kleinen RNA Kontrollen machen. 12 Im Vergleich zu handelsüblichen 384-Well-Plattformen mit vorbelegt TaqMan-Sonden, bietet die Kombination aus einem High-Throughput-Profiling-Plattform mit maßgeschneiderten Primer setzt hohe experimentelle Flexibilität. Die optimierte Multiplex qRT-PCR-Ansatz in Kombination mit der Dynamic Array-Plattform erfolgreich konnten wir gleichzeitig Bildschirm 48 Prostatakrebs Patientenseren auf Veränderungen in Stufen von 384 miRNA (Abbildung 4) und die Daten ohne Dorn in der Kontrollgruppe (dh synthetische microRNAs) zu normalisieren. 11 Trotz der Zunahme der Schritte von Proben der Vorbereitung bis zur Profilierung ergibt, ist das beschriebene Vorgehen eine zeit-und kostengünstig mit hohem Durchsatz Methode, um große Sample-Sets für miRNA Expression Profil, auch mit begrenzten Ausgangsmaterial.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

Die breite Beteiligung von miRNAs in kritischen Prozesse der Gehirnentwicklung, Gewebe Homöostase und Krankheit hat zu einem steigenden Interesse bei den Forschungs-und Pharma-Gemeinden geführt. Zur Untersuchung miRNAs, ist es unerlässlich, dass die Quantifizierung von microRNA Ebenen präzise und robust ist. Durch den Vergleich Wildtyp zu kleinen RNA defizienten embryonalen Stammzellen der Maus (MESC), zeigte uns einen Mangel an Genauigkeit und Robustheit, die in früheren Multiplex qRT-PCR-Techniken. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren, einschließlich Reinigung entfernt übermäßige Primer aus früheren Multiplex Schritte vor Singleplex Echtzeit-Erkennung, die dramatisch erhöht die Genauigkeit und Robustheit der Technik. Darüber hinaus erklären wir, wie die Durchführung der Technik auf einem Mikrofluidik-Chip bei Nanoliterbereich reduziert Kosten für Reagenzien und ermöglicht Zeit effektiv mit hohem Durchsatz miRNA Expression Profiling.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K Aufrufe.  University of California San Francisco. Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.