Gostaríamos de agradecer ao laboratório Blelloch para comentar sobre o texto. Este trabalho foi financiado por fundos para RB de NIH (K08 NS48118 e R01 NS057221), Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, Faculdade Prêmio New RN2-00906) ea Fundação Pew Charitable e FM a partir do Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

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	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

Alan Mir é um funcionário da Corporação Fluidigm. Caso contrário, não temos interesses financeiros de divulgar.

miRNAs são curtos (18-24 nucleotídeos), miRNA RNAs não-codificante, que regulam a expressão do gene pós-transcricionalmente por ambos os RNAs mensageiros de desestabilização (mRNA) e tradução inibindo a sua 6. O fato de que, pelo menos, um terço dos genes humanos contêm conservada vinculativo-sites em seus 3&#39;UTR e as interações evidente de miRNAs com genes para a proliferação, apoptose pluripotência e sugere uma contribuição crítica nas decisões célula destino, a homeostase do tecido e doenças como o câncer 6,7. perfis de expressão Portanto precisa microRNA são de ampla interesse. Para testar o multiplex publicado qRT-PCR miRNA protocolo de dois perfis de expressão que usamos MESC RNA pequeno deficiente como controles negativos. DGCR8 - / - as células são deficientes de todos os microRNAs canônica, enquanto Dicer - / -. Células falta micoRNAs tanto canônicos e não-canoncial 8,9 Comparar os níveis no tipo selvagem MES-to DGCR8 - / - células, nós descobrimos uma falta de precisão como vários expressa microRNAs 10 não foram detectados nas células do tipo selvagem 11. Alguns até mostraram níveis mais baixos de expressão em relação às células knockout (Figura 3a). Trabalhamos com a hipótese de que a falta de precisão pode ser causado pela cartilha maciça reporte de duas etapas consecutivas multiplex (RT e Pré-PCR) antes singleplex RT quantificação. No entanto, multiplex de amplificação pré-é necessário para aumentar a força do sinal, especialmente quando a concentração inicial de RNA é limitado. Purificando distância pré-PCR produtos de primers por seleção de tamanho em géis de poliacrilamida nativo (Figura 2), conseguimos demonstrar uma melhoria substancial na precisão através da detecção de microRNAs mais e uma perda de falso-positivos em ambos os Dgcr8 - / - e Dicer - / - fundos (Figuras 3a e 3b) Além disso, a abordagem modificada qRT-PCR permitiu a própria categorização de rara Dgcr8 independente / Dicer dependentes de pequenos RNAs (Figura 3b) 11. Portanto, um passo adicional para purificar primers excessiva longe de pré-PCR produto é claramente vantajosa, especialmente quando se utiliza primers multiplex grandes conjuntos por amostra. O número ideal de ciclos de pré-amplificação é determinado pelas concentrações de entrada de RNA. O equilíbrio para não sub ou overamplify deve ser orientada por indicações do experimento específico. Com mais de um milhar de microRNAs conhecida, o uso de padrão de 384 poços placas pode não ser ideal para o perfil de microRNA extensa, especialmente quando se comparam amostras múltiplas. A IFC Matriz Fluidigm dinâmico permite, com uma diminuição significativa das etapas de pipetagem e química necessário, testes de até 96 amostras individuais contra 96 ​​microRNAs diferentes em um único experimento (9216 reações) em nanolitros escala (6,7 nL). Para cada execução do software de análise fornece curvas de amplificação, mapas com códigos de cores e valores de calor de ciclo threshold (Ct). O perfil de grande escala simultânea reduz as variações experimentais e permite a normalização significa expressão de valor, que fora executa estratégias de normalização outros que fazem uso de controles de pequeno RNA. 12 Em comparação com 384 plataformas disponíveis comercialmente bem com sondas TaqMan pré-atribuído, a combinação de uma plataforma de perfil alto rendimento com conjuntos feitos por cartilha oferece flexibilidade experimental de alta. O otimizado multiplex abordagem qRT-PCR em combinação com a plataforma de matriz dinâmica com sucesso nos permitiu, simultaneamente, tela de 48 soros de pacientes com câncer de próstata por alterações nos níveis de miRNA 384 (Figura 4) e para normalizar os dados, sem aumento nos controles (ie sintéticos microRNAs). 11 Apesar do aumento de passos desde a preparação de amostras para resultados de perfil, a abordagem descrita é um tempo e custo-eficaz método de alto rendimento para o perfil grandes conjuntos de amostras de níveis de expressão de miRNA, mesmo com material de partida limitada.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

A ampla participação dos miRNAs em processos críticos subjacentes ao desenvolvimento homeostase do tecido, ea doença tem levado a um interesse crescente entre as comunidades científica e farmacêutica. Para estudar miRNAs, é essencial que a quantificação dos níveis de microRNA é precisa e robusta. Através da comparação do tipo selvagem de pequeno RNA deficiente do rato células-tronco embrionárias (MESC), que revelou uma falta de precisão e robustez em anteriores publicadas multiplex qRT-PCR técnicas. Aqui, descrevemos um método otimizado, incluindo purificação longe primers excessiva dos passos anteriores antes de multiplex singleplex detecção em tempo real, o que aumenta dramaticamente a precisão e robustez da técnica. Além disso, explicamos como executar a técnica em um chip microfluídico em volumes nanolitros reduz significativamente os custos de reagentes e tempo permitir eficaz alta taxa de transferência de perfil de expressão de miRNA.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K visualizações.  University of California San Francisco. Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.