Nos gustaría dar las gracias al laboratorio Blelloch para comentar sobre el texto. Este trabajo fue apoyado por fondos de RB de los NIH (K08 NS48118 y NS057221 R01), California Institute of Medicina Regenerativa (CIRM) (semillas subvención RS1-00161, Premio Nueva Facultad RN2-00906) y el Pew Charitable Trust y de la FM wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

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Alan Mir es un empleado de la Corporación Fluidigm. De lo contrario, no tengan intereses financieros de revelar.

miRNAs son cortas (18-24 nucleótidos), no codificantes miARN ARN que regulan la expresión de genes post-transcripcional por dos moléculas de ARN mensajero de desestabilización (ARNm) y la inhibición de su traducción. 6 El hecho de que al menos un tercio de los genes humanos contienen conserva vinculantes en sus sitios 3&#39;UTR y las interacciones evidentes de miRNAs con genes para la proliferación de pluripotencia y la apoptosis sugiere una contribución decisiva en las decisiones del destino celular, la homeostasis de los tejidos y enfermedades como el cáncer. 6,7 perfiles de microARN Por lo tanto precisa de expresión son de amplio de interés. Para probar el multiplex publicado QRT-PCR la expresión miARN perfiles de protocolo 2 se utilizó ARN pequeños MESC deficiente como controles negativos. DGCR8 - / - las células son deficientes de todos los microARN canónica, mientras que Dicer - / -. MicoRNAs células carecen de los canónicos y no-canoncial 8,9 Al comparar los niveles de tipo salvaje economía de mercado a DGCR8 - / - las células, hemos descubierto la falta de precisión ya que varios expresaron 10 microARN no se detectaron en las células de tipo salvaje 11. Algunos incluso mostraron menores niveles de expresión en relación con las células de apoyo (Figura 3a). La hipótesis de que la falta de precisión puede ser causado por el primer gran aporte de los dos pasos consecutivos multiplex (RT-PCR y Pre) antes de singleplex RT-cuantificación. Sin embargo, la pre-amplificación multiplex es necesario para mejorar la potencia de la señal, sobre todo cuando la concentración inicial de ARN es limitado. Mediante la purificación de distancia pre-PCR de los cebadores de selección de tamaño en geles de poliacrilamida nativos (Figura 2), hemos podido demostrar una mejora sustancial en la precisión de la detección de más microARN y una pérdida de señales de falsos positivos, tanto en DGCR8 - / - y Dicer - / - Fondos (Figuras 3a y 3b) Además de la modificación de QRT-PCR enfoque permitió la clasificación adecuada de rara DGCR8 independiente / dependiente de ARN Dicer pequeñas (Figura 3b) 11. Por lo tanto, un paso adicional para purificar primers excesiva lejos de pre-PCR producto es claramente ventajoso, especialmente cuando se utilizan grandes conjuntos de imprimación multiplex por muestra. El número óptimo de ciclos de amplificación pre-viene determinada por la concentración de entrada del ARN. El saldo que no en-o overamplify debe guiarse por los datos relativos a la experiencia específica. Con más de un millar de microARNs conocidos, el uso de la norma 384-y las placas pueden no ser óptimos para crear perfiles de microARN extensa, especialmente cuando se comparan varias muestras. La IFC Fluidigm matriz dinámica permite, con una disminución significativa de los pasos de pipeteado y la química necesaria, las pruebas de hasta 96 muestras individuales en contra de 96 microARN diferentes en un solo experimento (9216 reacciones) a escala de nanolitros (6,7 nL). Para cada ejecución del software de análisis proporciona curvas de amplificación, un código de colores mapas de calor y los valores umbral del ciclo (Ct). La simultánea a gran escala de perfiles reduce las variaciones experimentales y permite la normalización de valor medio de expresión, que supera a otras estrategias de normalización que hacen uso de pequeños controles de ARN 12. En comparación con los disponibles en el mercado 384 plataformas y con pre-asignado sondas TaqMan, la combinación de una plataforma de perfiles de alto rendimiento con juegos de cebadores a medida ofrece flexibilidad experimental de alta. El multiplex optimizado QRT-PCR enfoque en combinación con la plataforma de matriz dinámica nos ha permitido con éxito a la pantalla al mismo tiempo el cáncer de próstata 48 sueros de pacientes de alteraciones en los niveles de miRNA 384 (Figura 4) y para normalizar los datos, sin aumento en los controles (es decir, sintéticos microRNAs). 11 A pesar del aumento de los pasos desde la preparación de las muestras con los resultados de perfiles, el enfoque descrito es un tiempo y coste-efectivo método de alto perfil de grandes conjuntos de muestras de los niveles de expresión de miRNA, incluso con material de partida limitada.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

La amplia participación de los miRNAs en los procesos críticos que subyacen al desarrollo, el tejido de la homeostasis y la enfermedad ha llevado a un creciente interés entre las comunidades científicas y farmacéuticas. Para el estudio de miRNAs, es esencial que la cuantificación de los niveles de microARN es preciso y robusto. Mediante la comparación de tipo salvaje a los pequeños ARN células madre embrionarias de ratón deficiente (MESC), que reveló una falta de precisión y solidez en el anterior, publicado QRT-PCR multiplex técnicas. Aquí se describe un método optimizado, incluyendo purificación de distancia excesiva de primers multiplex pasos previos antes de la detección singleplex tiempo real, lo cual incrementa la precisión y robustez de la técnica. Además, se explica cómo realizar la técnica en un chip de microfluidos en volúmenes nanolitros reduce significativamente los costos de reactivos y el tiempo lo permite eficaz miRNA de alto rendimiento de perfiles de expresión.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K vistas.  University of California San Francisco. A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.