Nous tenons à remercier le laboratoire Blelloch pour commenter le texte. Ce travail a été soutenu par des fonds à partir de RB NIH (K08 NS48118 et R01 NS057221), du California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (Subvention de démarrage RS1-00161, New Faculty Award RN2-00906) et le Pew Charitable Trust et à la bande FM de la Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

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Alan Mir est un employé de Fluidigm Corporation. Sinon, nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts financiers à divulguer.

miARN sont courtes (18-24 nucléotides), non-codante miARN ARN qui régulent l&#39;expression génique post-transcriptionnelle par les deux ARN messagers déstabilisant (ARNm) et en inhibant leur traduction. 6 Le fait qu&#39;au moins un tiers des gènes humains contiennent conservé binding-sites dans leur 3&#39;UTR et les interactions avec les miARN évident de gènes de pluripotence, la prolifération et l&#39;apoptose suggère une contribution essentielle dans les décisions du destin cellulaire, l&#39;homéostasie des tissus et des maladies comme le cancer. 6,7 conséquent précise des profils d&#39;expression de microARN sont des grands intérêt. Pour tester le multiplex publié qRT-PCR profilage miARN expression 2, nous avons utilisé des petits ARN MESC déficient comme témoins négatifs. DGCR8 - / - cellules sont déficientes de toutes les microARN canoniques, tandis que Dicer - / -. MicoRNAs cellules manquent tant canoniques et non canoncial 8,9 La comparaison des niveaux de type sauvage MES-à DGCR8 - / - cellules, nous avons découvert un manque de précision que plusieurs ont exprimé 10 microARN n&#39;ont pas été détectés dans les cellules de type sauvage 11. Certains ont même montré des niveaux d&#39;expression plus faible par rapport aux cellules KO (figure 3a). Nous avons supposé que le manque de précision pourrait être causé par l&#39;amorce massifs report de deux étapes consécutives de multiplex (RT-PCR et pré) avant singleplex RT-quantification. Toutefois, multiplex de pré-amplification est nécessaire de renforcer la force du signal, en particulier lorsque la concentration de départ de l&#39;ARN est limité. En purifiant l&#39;écart des produits pré-PCR à partir des amorces par une sélection de taille sur des gels de polyacrylamide natif (figure 2), nous avons pu démontrer une amélioration substantielle de la précision en détectant plus de microARN et une perte de faux signaux positifs dans les deux Dgcr8 - / - et Dicer - / - milieux (figures 3a et 3b) En outre, le modifiés qRT PCR approche a permis pour la catégorisation appropriée des rares Dgcr8 indépendante / dépendante Dicer petits ARN (figure 3B) 11. Par conséquent, une étape supplémentaire pour purifier amorces excessive loin de pré-PCR produit est clairement avantageux, surtout quand en utilisant l&#39;amorce multiplexe de grands ensembles par échantillon. Le nombre optimal de pré-amplification des cycles est déterminée par les concentrations d&#39;ARN d&#39;entrée. Le solde de ne pas sous-ou overamplify devrait être guidé par des indications sur l&#39;expérience spécifique. Avec plus d&#39;un millier de microARN connue, l&#39;utilisation de la norme 384 puits ne peut être optimale pour le profilage de microARN longue, surtout quand on compare plusieurs échantillons. L&#39;IFC de Fluidigm tableaux dynamiques permet, avec une diminution significative des étapes de pipetage et de la chimie nécessaire, des tests jusqu&#39;à 96 échantillons individuels contre 96 microARN différents en une seule expérience (9216 réactions) à l&#39;échelle du nanolitre (6,7 nL). Pour chaque exécution du logiciel d&#39;analyse fournit les courbes d&#39;amplification, des cartes thermiques de couleur et les valeurs seuils de cycle (Ct). Le simultanées à grande échelle de profilage réduit les variances expérimentales et permet pour la normalisation expression de valeur moyenne, ce qui surpasse les autres stratégies de normalisation qui utilisent des contrôles petit ARN. 12 Comparé à 384 plates-formes disponibles dans le commerce bien avec des sondes TaqMan pré-attribué, la combinaison d&#39;une plateforme de profilage à haut débit avec des ensembles d&#39;amorces sur-mesure offre une grande flexibilité expérimentale. Le multiplex optimisé qRT PCR démarche en combinaison avec la plateforme Dynamic Array succès nous a permis de cribler simultanément 48 sérums de patients cancer de la prostate pour les altérations des niveaux de 384 miARN (Figure 4) et pour normaliser les données, sans pic de commandes (ie synthétiques microARN). 11 Malgré la hausse des étapes de la préparation des échantillons à des résultats de profilage, l&#39;approche décrite est un temps et rentable méthode à haut débit fixe au profil large échantillon pour des niveaux d&#39;expression des miRNA, même avec du matériel de départ limité.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

La large participation des miARN dans les processus critiques qui sous-tendent le développement, les tissus homéostasie et la maladie a conduit à un intérêt surgi chez les communautés scientifiques et pharmaceutiques. Pour étudier les miRNAs, il est essentiel que la quantification des niveaux microARN est précise et robuste. En comparant type sauvage aux petits ARN des cellules déficientes souches embryonnaires de souris (CESM), nous a révélé un manque de précision et de robustesse dans les précédentes publiées multiplexe qRT-PCR. Ici, nous décrivons une méthode optimisée, y compris la purification de suite amorces excessive à partir des étapes précédentes avant la détection multiplex singleplex temps réel, ce qui augmente considérablement la précision et la robustesse de la technique. Par ailleurs, nous expliquons comment effectuer la technique sur une puce microfluidique à des volumes nanolitre réduit considérablement les coûts de réactif et le temps le permet effective des profils à haut débit l&#39;expression de miRNA.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d&#39;une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d&#39;expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l&#39;échantillon.

Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l&#39;échelle nanolitres sur l&#39;IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

high-throughput-microrna-profiling-optimized-multiplex-qrt-pcr-at

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K vues.  University of California San Francisco. Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d'une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d'expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon.