Vorremmo ringraziare il laboratorio Blelloch per commentare il testo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di RB dal NIH (K08 NS48118 e R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (semi di Grant RS1-00161, Premio Facoltà di New RN2-00906) e Pew Charitable Trust e FM dal Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

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	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

Alan Mir è un dipendente di Fluidigm Corporation. Altrimenti, non abbiamo interessi finanziari di rivelare.

miRNA sono brevi (18-24 nucleotidi) non codificanti miRNA RNA, che regolano l&#39;espressione genica post-trascrizionale di RNA messaggero sia destabilizzante (mRNA) e inibendo la loro traduzione. 6 Il fatto che almeno un terzo dei geni umani contengono conservato vincolanti nei loro siti-3&#39;UTR e le interazioni evidenti dei miRNA con i geni per la pluripotenza, la proliferazione e l&#39;apoptosi suggerisce un contributo critico nelle decisioni il destino della cellula, omeostasi dei tessuti e malattie come il cancro. 6,7 Quindi precisa profili di espressione di microRNA sono di ampio interesse. Per testare la multisala pubblicato qRT-PCR l&#39;espressione protocollo miRNA profiling 2 abbiamo usato piccoli Mesc carente RNA come controlli negativi. DGCR8 - / - cellule sono carenti di tutti i microRNA canonica, mentre Dicer - / -. Cellule mancanza micoRNAs sia canoniche e non canoncial 8,9 Confrontando i livelli di tipo selvatico MES-to DGCR8 - / - cellule, abbiamo scoperto la mancanza di precisione, come espresso più 10 microRNA non sono stati rilevati nel wild-type cellule 11. Alcuni addirittura hanno mostrato livelli di espressione più bassi rispetto alle cellule ad eliminazione diretta (Figura 3). Abbiamo ipotizzato che la mancanza di precisione potrebbe essere causato dal fondo massiccia riporto di due multiplex fasi consecutive (RT e Pre-PCR) prima singleplex RT-quantificazione. Tuttavia, multiplex di pre-amplificazione è necessaria per migliorare la potenza del segnale, soprattutto quando la concentrazione di partenza di RNA è limitata. Purificando via pre-PCR prodotti da primer di selezione del formato in gel di poliacrilammide nativo (Figura 2), abbiamo potuto dimostrare un sostanziale miglioramento della precisione rilevando più microRNA e una perdita di falsi segnali positivi in entrambi i Dgcr8 - / - e Dicer - / - sfondi (Figure 3a e 3b) Oltre la modifica qRT-PCR approccio ha permesso per la categorizzazione corretta di rara Dgcr8 RNA dipendente indipendente / Dicer di piccole dimensioni (Figura 3b) 11. Quindi un ulteriore passo per purificare primer eccessiva distanza dalla pre-PCR prodotto è chiaramente vantaggioso, soprattutto quando si utilizzano grandi multiplex fondo set per campione. Il numero ottimale di pre-amplificazione dei cicli è determinata dalla concentrazione di RNA di ingresso. Il saldo di non sottovalutare o overamplify dovrebbe essere guidato da indicazioni specifiche dell&#39;esperimento. Con oltre un migliaio di microRNA noto, l&#39;uso di standard di 384 pozzetti potrebbe non essere ottimale per il profiling microRNA ampia, soprattutto quando si confrontano campioni multipli. L&#39;IFC Fluidigm Array dinamico consente, con una diminuzione significativa di passi pipettaggio e della chimica necessari, i test fino a 96 campioni individuali contro 96 differenti microRNA in un singolo esperimento (9216 reazioni) a scala nanolitri (6,7 nL). Per ogni esecuzione il software di analisi fornisce le curve di amplificazione, colori mappe di calore e dei valori del ciclo soglia (Ct). Il simultaneo su larga scala profilazione riduce le variazioni sperimentali e consente la normalizzazione valore medio di espressione, che fuori effettua strategie di normalizzazione altri che fanno uso di piccoli controlli RNA 12. Rispetto al commercio 384 piattaforme bene con pre-assegnato sonde TaqMan, la combinazione di un elevato throughput piattaforma profilatura con misura set di primer offre un&#39;elevata flessibilità di sperimentazione. La ottimizzato multiplex qRT-PCR approccio in combinazione con la piattaforma di array dinamici con successo ci ha permesso di schermo contemporaneamente 48 cancro alla prostata sieri dei pazienti per le alterazioni dei livelli di 384 miRNA (Figura 4) e per normalizzare i dati senza picchi nei controlli (cioè sintetici microRNA). 11 Nonostante l&#39;aumento dei passaggi dalla preparazione dei campioni ai risultati profilazione, l&#39;approccio descritto è un tempo-e conveniente metodo throughput elevato per set di profilo ampio campione per i livelli di espressione di miRNA, anche con limitata materiale di partenza.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

Un ampio coinvolgimento dei miRNA nei processi critici di fondo dello sviluppo, dell&#39;omeostasi dei tessuti e la malattia ha portato ad un interesse in aumento fra le comunità di ricerca e farmaceutica. Per studiare miRNA, è essenziale che la quantificazione dei livelli di microRNA è preciso e robusto. Confrontando wild-type di piccoli RNA deficienti cellule staminali embrionali di topo (Mesc), ci ha rivelato una mancanza di precisione e robustezza nelle precedenti pubblicati qRT multiplex-PCR tecniche. Qui, descriviamo un metodo ottimizzato, anche purificare lontano primer eccessivo passi multiplex precedente prima rilevazione singleplex tempo reale, che aumenta notevolmente la precisione e la solidità della tecnica. Inoltre, abbiamo spiegato come eseguire la tecnica su un chip microfluidica a volumi nanoliter riduce significativamente i costi dei reagenti e il tempo lo permette efficace ad alta velocità miRNA profili di espressione.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K Views.  University of California San Francisco. Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.