Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (MSH-95368, MOP-89773 und MOP-106623 bis CZ) und der Canada Foundation for Innovation unterstützt. SCM ist der Empfänger einer CIHR / Canadian Association of Gastroenterology Postdoc-Stipendium. CZ ist ein CIHR New Investigator.

1. Propagierung von Trichuris muris Eier <ol><li> So generieren Sie neue Chargen von Trichuris muris Eier, infizieren 20-30 immundefizienten Mäusen (zB NOD.Cg-Prkdc scid IL2RG tm1Wjl / SzJ (NSG) oder 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) oder genetisch anfälligen Mäusen ( zB. AKR / J), die 6-8 Wochen alt, mit ca. 300 Trichuris muris Eier durch orale Gabe sind. </li><li> Nach 32-35 Tage opfern die Mäuse durch CO 2-Erstickung. </li><li> Expose der Bauchseite der Maus und nassen Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette fassen die Bauchhaut und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. Schneiden Sie die Haut an den Bauch-Inhalte setzen. </li><li> Identifizieren des Blinddarms und des proximalen Dickdarms, und entfernen Sie sie. </li><li> Setzen Sie den Blinddarm und proximalen Dickdarm in einer 10 cm Petrischale mit Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit 500 U / ml Penicillin und 500 ug / ml Streptomycin (P / S). Schneiden Sie den Blinddarm öffnen, um das Lumen und die Würmer ausgesetzt. Mit einer Pinzette Ort Blinddarm in ein Becherglas mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und leicht schütteln, um Kot zu entfernen. </li><li> Zurück Zökum bis Petrischale mit glatten gebogenen Pinzette (Roboz RS-5047) vorsichtig herausziehen Würmer und legen Sie sie in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 5 ml DMEM + P / S. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse. </li><li> Legen Sie 6-Well Platte in einer Tupperware-Container mit einem feuchten Papiertuch gegen Feuchtigkeit und bei 37 ° C zu halten für 4 Stunden. </li><li> Nach 4 Stunden entfernen Würmer mit glatten gebogenen Pinzette und teilen Sie sie in 2 neuen Brunnen der 6-Well-Platte mit 5 ml DMEM + P / S. Ernten Sie die Inhalte der ursprünglichen gut und in einem 15 ml Falcon-Röhrchen. Spin Röhrchen bei 3000 rpm und entfernen und behalten Überstand als 4 Std. Antigen (kann für die Zell-Restimulation nach PBS Dialyse, wo typische Protein Renditen sind 10-20 mg pro 20 Mäusen verwendet werden) und resuspendieren Ei-haltige Pellet in autoklaviert Leitungswasser. </li><li> Legen Sie die 6-Well-Platte wieder bei 37 ° C über Nacht. Entfernen und Entsorgen der Würmer. Ernten Sie die Inhalte der Brunnen in ein Falcon-Röhrchen und drehen mit 3000 rpm für 5 min. Überstand entfernen und behalten so über Nacht Antigen (für Trichuris Ag spezifischen Antikörper-Isotyp ELISAs nach PBS Dialyse, wo typische Protein Renditen sind 10-20 mg pro 20 Mäusen verwendet werden) und resuspendieren Ei-haltige Pellet in autoklaviert Leitungswasser. </li><li> Kombinieren Sie 4 Stunden und über Nacht Eier und filtern Sie die Eier durch die 70μm Sieb übrig gebliebene Würmer entfernen Sie dann in eine 75 cm 2-Kolben übertragen. Halten Sie Flasche an einem dunklen Ort in Folie für 6 Wochen abgedeckt bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Wash Eier in autoklaviert Leitungswasser und resuspendieren bei 50 lebensfähige Eier in 50 ul. Um dies zu tun, Zentrifuge Eier bei 3000 rpm für 5 min und Resuspendieren in ~ 50ml sterile Leitungswasser. Entfernen 50 pl Eier und auf ein Glasplättchen. Mit dem 40-facher Vergrößerung zählen die Anzahl der lebensfähigen embryonierten Eier in den 50 pl. Verdünnen Sie Eier zu 50 lebensfähige Eier in 50 ul geben. Für Bilder von lebensfähigen Eier finden Sie in der Studie von Kopper und Mansfield 16. </li></ol> 2. Akute Infektionen der experimentellen Mäuse mit Trichuris muris Eier (200 Eier / Maus) <ol><li> Gründlich resuspendieren Eier und entfernen Sie genügend Volumen, um die Anzahl der Mäuse zu behandeln X 2 (zB für 10 Mäuse nehmen 200 ul x 10 Mäusen x 2 = 4 ml Eier) und legen Sie sie in eine 14 ml Schnappdeckel Röhre. </li><li> Kehren Sie die 14 ml Schnappdeckel Rohr zu mischen. Rufen Sie 200 ul von Eiern in 1 ml Spritze auf eine geeignete Größe Fütterung Nadel (für Mäuse mit einem Gewicht 25 Gramm wir benutzten dazu 18 Spur 1 1 / 2 &quot;Nadeln). In der einen Hand scruff der Maus und mit der anderen Hand verwalten Eier durch orale Gabe . </li><li> Warten Sie 21 Tage. </li></ol> 3. Experimentelle Ernte <ol><li> Am Tag 21 Opfer die Mäuse mit CO 2. </li><li> Entnehmen Sie das Blut von Mäusen durch Herzpunktion, in einem nicht-heparinisierten Spritze, und lagern bei 4 ° C. Am nächsten Tag isolieren Serum und bei -20 ° C. Serum kann für den Nachweis von Trichuris-spezifischen IgG und IgE durch ELISA verwendet werden. </li><li> Expose der Bauchseite der Maus und nassen Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette fassen die Bauchhaut und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. Schneiden Sie die Haut und des darunterliegenden Membran auf die Bauch-Inhalte setzen. </li><li> Identifizieren Sie die Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm. Besorgen Sie sich die Blinddarm mit einer Pinzette und ziehen Sie aus der Bauchhöhle. Mit anderen Pinzette push Dünndarm nach rechts Freilegung der mesenterialen Lymphknoten (MLNs). Entfernen Sie die MLNs man aufpassen, nicht in den Darm und in ein 15 ml Falcon mit 2 ml Medium geschnitten. Auf Wunsch können diese bearbeitet und restimuliert in vitro (4x10 6 / ml in 1 ml in 24-Well-Platten mit 1 pg / ml αCD3/CD28 oder mit 50μg/ml 4h Trichuris Ag) für 72 Stunden für Zytokin-Analyse durch ELISA und intrazellulären fLow-Zytometrie. </li><li> Schneiden Sie den Blinddarm und Dickdarm. </li><li> Mit einer Pinzette, Push-out fäkalen Pellets aus distalen Kolon und in ein 2 ml Axygen Röhre. Einfrieren bei -20 ° C. Fecal Pellets kann durch Western-Blot die Expression von Resistin-ähnlichen Molekül-β (RELM-β) analysiert werden. </li><li> Entfernen Sie die Spitze des Blinddarms (~ 0,5 cm). So entfernen Sie Kot halten Blinddarm Spitze mit einer Pinzette und bündig mit PBS unter Verwendung einer 3-ml-Spritze und 22-Gauge-Nadel in eine Petrischale. Legen Sie in frischen 4% Paraformaldehyd in 5 ml Falcon Schnappdeckel Röhre. Lagerung bei 4 ° C. Diese können in Paraffin eingebettet, geschnitten und montiert auf Folien für die histologische Analyse. </li><li> Nehmen Sie ein Stück proximalen Kolon (~ 1 cm) für RNA. Put Probe in 2 ml Axygen Rohr mit 500 ul RNAlater. Lagerung bei 4 ° C. Diese Proben können mRNA-Expression von qPCR analysiert werden. </li><li> Platzieren Sie den Rest des Blinddarms in einem markierten Petrischale und bei -20 ° C. </li></ol> 4. Enumeration von Trichuris muris Würmer im Blinddarm <ol><li> Entfernen Blinddarm aus dem Gefrierschrank und in einer Petrischale mit ca. 5 ml Wasser. </li><li> Mit Schere, aufgeschnitten Blinddarm mit dem Lumen aussetzen. </li><li> Halten Sie den Blinddarm mit einer Pinzette und kräftig schütteln den Blinddarm, die Mehrheit der Kot zu entfernen. </li><li> Transfer Blinddarm zu einem anderen Petrischale mit Wasser und mit glatten gebogenen Pinzette vorsichtig abkratzen IECs das darunter liegende Gewebe. </li><li> Transfer-Blinddarm, um eine neue Petrischale mit Wasser und kräftig kratzen verbleibende Gewebe mit der Pinzette, riss das Gewebe in kleine Stücke. </li><li> Verwenden Sie ein Binokular, um alle die Würmer in allen 3 der Petrischalen zählen. Wie finden Sie einen Wurm entfernen Sie sie aus der Schüssel auf den gleichen Wurm sicher nicht doppelt gezählt. Wenn Würmer beschädigt sind (dh in zwei Hälften zerbrochen) zählen nur dick oder dünn Enden an eine genaue Anzahl zu bekommen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Trichuris muris Infektion Modell ermöglicht es Forschern, Parasitenbelastung und systemische Immunantwort, sowie histologisch untersuchen die entzündliche Reaktion in den distalen Blinddarm zu quantifizieren. Wenn das Lumen des geernteten Blinddarm ausgesetzt ist, kann Trichuris Würmer aufgezählt mit einem Binokular (Abbildung 1A-B) sein. Parameter der Immunität gegen Trichuris auch Antikörperisotyp Wechsel zu IgG1 (verbunden mit Th2-Typ Immunität) in resistenten Tieren und IgG2a (assoziiert mit Th1-Typ Immunität) in empfänglichen Tieren (Abbildung 1C). Expression des Becherzelle-spezifisches Protein Resistin-ähnlichen Molekül-β (RELM-β) ist mit Abstand der Trichuris assoziiert und ist nachweisbar durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 2). Der distale Teil des Blinddarms kann mit Periodic Acid-Schiff (PAS) gefärbt werden, um Pokal-Zell-Reaktionen und das Ausmaß der Darmentzündung in Reaktion auf eine Infektion (Abbildung 3) zu beurteilen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die Quantifizierung der Immunität gegen Trichuris muris. (A) Resistant (B6) Mäuse vertreiben Trichuris muris bis Tag 21 nach der Infektion. Im Gegensatz dazu werden anfällig (AKR / J) Mäusen chronisch mit Trichuris infiziert, wodurch Parasiten Establishment. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 4-8 Tieren pro Gruppe. (B) Worms gezählt mit einem Binokular. Top Panel zeigt Würmer in Isolation, zeigt Bodenplatte Würmer in Gegenwart von IECs und Kot. (C) Trichuris-spezifischen IgG2a Titer mittels ELISA verdünntes Serum (1:2 Verdünnung, beginnend bei 1:20 Verdünnung und endend bei 1:2560) auf Platten mit Ausscheidungsorgane Trichuris Antigen (O / N Ag, 5 ug / beschichtet bestimmt ml). Anfällig AKR / J-Mäuse haben insbesondere höhere Trichuris-spezifischen Serum-IgG2a als resistent B6 Mäusen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Die Clearance von Trichuris muris ist mit der Expression des Becherzelle-spezifisches Protein RELM-β 7 zugeordnet. RELM-β Produktion von fäkalen Pellets aus Trichuris-infizierten resistenten (B6) erfasst werden, nicht aber anfällig (AKR / J) Mäusen durch Western-Blot-Analyse. Jede Spur ist repräsentativ für ein einzelnes Tier, (N) = Naive, (Tm) = 21-Tage-Trichuris infizierten Mäusen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Die histologische Untersuchung des distalen Blinddarm folgenden Trichuris Infektion. 5-7 um Abschnitte des distalen Blinddarm mit PAS gefärbt. Goblet Zell-Hyperplasie und Schleimproduktion sind offensichtlich in resistenten (B6), aber nicht anfällig (AKR / J) Mäusen nach Trichuris Infektion.

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	<li>Cliffe, L. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Trichuris+muris+system:+a+paradigm+of+resistance+and+susceptibility+to+intestinal+nematode+infection.">The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection.</a> Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).</li><li>Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-mediated+regulation+of+chronic+intestinal+helminth+infection.">Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection.</a> J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).</li><li>Bancroft, A. J., Grencis, R. 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Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von The University of British Columbia gesetzt durchgeführt.

Dieses Protokoll Details einer Standard-Hochdosis akuten Trichuris muris Infektion, die modifiziert, wie von dem Prüfer erforderlich werden kann. Zum Beispiel können Mäuse getötet und sein Gewebe an verschiedenen Tagen geerntet. Um festzustellen, dass die Mäuse erfolgreich voller Wurm Belastung etablierten sie sich am Tag 14 geopfert werden, an welcher Stelle alle Mäuse sollte eine Belastung von etwa 200 Würmer tragen. Mäuse können auch für 32 Tage, wo kein Wurm erkannt Reife erreicht haben und würde mit dem Host für die Dauer seines Lebens bleiben infiziert werden. Darüber hinaus kann das Protokoll angepasst an chronischen Trichuris muris Infektion Modell sein. Dazu kann die verabreichte Dosis auf Ei einer niedrigen Dosis Infektion (ca. 30 Eier) eingestellt werden. Bei dieser Dosis nicht normalerweise resistent Mäusen eine schützende Th2-Antwort induzieren, sondern erzeugen eine Th1-Antwort und Pflege einer Belastung von ca. 20 Würmer 17. Ein Vorteil der Trichuris muris Infektion Modell gegenüber anderen Infektionen Modellen ist, dass im Allgemeinen die infizierten Mäuse zeigen keine Morbidität oder Mortalität. Es gibt jedoch Faktoren, die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können, dass die Forscher sollten sich bewusst sein. Der erste Faktor ist der Hintergrund Stamm der Mäuse. Wie in den Ergebnissen dargestellt, C57BL / 6 Mäuse resistent sind und AKR / J-Mäuse sind anfällig, und ebenso können andere Inzuchtstämme haben eine andere Infektion Profile. Deshalb ist es wichtig, dass der Forscher sich der Hintergrund Stamm ihre Mäuse und geeignete Kontroll-Mäusen. Darüber hinaus kann es mit der Maus zu Maus Variation in Parasit-Clearance, so gibt es keinen Grund zur Sorge, wenn einige in der Regel resistent Kontrollmäuse bis zu 30 Würmer in 21 Tage nach der Infektion. Wie gut, wird anfälliger Mäuse nicht immer einen vollen 200-count-Wurm Last, sondern kann von etwa 75 bis 200 Würmer pro Blinddarm-Bereich. Diese Variante kann auch durch natürliche Variation in der Darmflora von Mäusen in verschiedenen Einrichtungen untergebracht berücksichtigt werden. Ein Faktor, wirkt sich nachteilig auf Trichuris muris Infektion ist das Vorhandensein von Maden. Pinworms infizieren die gleichen anatomischen Stelle als Trichuris und induzieren eine Immunantwort, die die Auslegung des Trichuris Studien verwechseln kann. Darüber hinaus pinworm Behandlung (Albendazol, Fenbendazol) tötet auch Trichuris. In diesem experimentellen Verfahren, verwenden wir Mäuse, die unter bestimmten-Pathogen-freien Bedingungen eingehalten werden, und es ist äußerst wichtig, dass Versuchsmäusen gehalten pinworm frei vor und während Trichuris muris Infektion sein. Einige kleinere Punkte Forscher bewusst sein sollten: <ol><li> Eier sollten in Wasser, nicht PBS beibehalten werden. </li><li> Eier sind sehr schwer und sollte daher vor der Auslieferung an jede Maus resuspendiert werden. Auch Last nur genug Volumen von Eiern zu einem Maus zu einem Zeitpunkt, zu infizieren, da sie in der Spritze zu begleichen. </li><li> Einige seltene Stämme zeigen geschlechtsspezifische Unterschiede in Infektiosität, sondern in den meisten Fällen entweder Männchen oder Weibchen kann für Trichuris muris Infektionen verwendet werden. </li><li> Naive Mäuse können in den gleichen Käfig wie infizierte Mäuse untergebracht werden, da es keine Bedenken von horizontalem Transfer Infektion mit diesem Modell. </li></ol> Insgesamt ist Trichuris muris Infektion ein einfaches Verfahren, um die Modelle Th2-abhängigen Immunität führen und kann an einzelne Forscher Bedürfnisse angepasst werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Tierfütterung Needles (18 x 1 ½ &quot;) </td><td> Popper </td><td> 7912 </td><td></td></tr><tr><td> Glatte gebogenen Pinzette </td><td> Roboz </td><td> RS-5047 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Prkdc scid IL2R gtm1Wjl / SzJ (NSG) </td><td> Jackson Laboratories </td><td> 005557 </td><td> Dies sind die Mäuse verwendeten wir jedoch sollte jede immundefizienten Mäusen oder anfälligen Stamm zu arbeiten. </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Qiagen </td><td> 76104 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml Röhrchen </td><td> Axygen </td><td> MCT-200-C </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Falke </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 6 Well-Platten </td><td> Falke </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Wissenschaft </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> α-Antikörper RELMβ </td><td> PeproTech Inc </td><td> 0694270Rb </td><td></td></tr></tbody></table>

trichuris muris infection: a model of type 2 immunity and inflammation in the gut

Trichuris muris ist eine natürliche Erreger von Mäusen und ist biologisch und antigenetisch ähnlich Spezies Trichuris, dass Mensch und Tier 1 zu infizieren. Infektiöse Eier durch orale Gabe, schlüpfen in die distalen Dünndarm gegeben sind, dringen in die Darmepithelzellen (IECs), die Linie der Krypten des Blinddarms und proximalen Kolon und bei der Reifung der Würmer Eier Freisetzung in die Umwelt 1. Dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Faktoren zu prüfen, dass die Kontrolle CD4 + T-Helferzellen (Th)-Zell-Aktivierung sowie Änderungen im Darmepithel. Die Immunantwort, die in resistenten Inzuchtstämme, wie C57BL / 6 und BALB / c auftritt, wird von Th2 polarisiert Zytokine (IL-4, IL-5 und IL-13) und Vertreibung von Würmern während Th1-assoziierte Zytokine (IL charakterisiert -12, IL-18, IFN-γ) zu fördern chronische Infektionen bei genetisch anfälligen AKR / J-Mäuse 2-6. Th2-Zytokine fördern physiologische Veränderungen in der Darm-Mikroumgebung einschließlich schnellen Umsatz von IECs, Pokal-Zell-Differenzierung, Rekrutierung und Veränderungen in epithelialen Permeabilität und Kontraktion der glatten Muskulatur, die alle in Wurm Vertreibung 7-15 verwickelt waren. Hier haben wir ausführlich ein Protokoll für die Verbreitung Trichuris muris Eier, die in nachfolgenden Experimenten verwendet werden können. Wir bieten auch eine Probe experimentelle Ernte mit Vorschlägen für post-Infektion Analyse. Insgesamt wird dieses Protokoll Forscher mit den grundlegenden Tools, um eine Trichuris muris Maus Infektion Modell, das verwendet werden, um Fragen zu Th Neigung in den Magen-Darm-Trakt sowie Immun-Effektor-Funktionen von IECs Adresse kann wahrnehmen können.

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Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infektion ist ein Darm-Modell von Th2 Immunität, wo resistente Mäuse generieren eine schützende Th2-Antwort und anfälligen Mäusen erzeugen eine pathologische Th1-Antwort.

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

trichuris-muris-infection-model-type-2-immunity-inflammation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

16.2K Aufrufe.  University of British Columbia. Trichuris muris Infektion ist ein Darm-Modell von Th2 Immunität, wo resistente Mäuse generieren eine schützende Th2-Antwort und anfälligen Mäusen erzeugen eine pathologische Th1-Antwort.

Serie: Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects the life quality of millions of people worldwide. IBD symptoms include abdominal pain, diarrhea, and rectal bleeding, which may result from the interactions among gut microbiota, food components, intestinal epithelial cells, and immune cells. It is of particular importance to assess how each key gene expressed in intestinal epithelial and immune cells affects inflammation in the colon. G protein-coupled taste receptors, including G protein subunit &#945;-gustducin and other signaling proteins, have been found in the intestines. Here, we use &#945;-gustducin as a representative and describe a dextran sulfate sodium (DSS)-induced IBD model to evaluate the effect of gustatory gene mutations on gut mucosal immunity and inflammation. This method combines gene knockout technology with the chemically induced IBD model, and thus can be applied to assess the outcome of gustatory gene nullification as well as other genes that may exuberate or dampen the DSS-induced immune response in the colon. Mutant mice are administered with DSS for a certain period during which their body weight, stool, and rectal bleeding are monitored and recorded. At different timepoints during administration, some mice are euthanized, then the sizes and weights of their spleens and colons are measured and gut tissues are collected and processed for histological and gene expression analyses. The data show that the &#945;-gustducin knockout results in excessive weight loss, diarrhea, intestinal bleeding, tissue damage, and inflammation vs. wild-type mice. Since the severity of induced inflammation is affected by mouse strains, housing environment, and diet, optimization of DSS concentration and administration duration in a pilot experiment is particularly important. By adjusting these factors, this method can be applied to assess both anti- and pro-inflammatory effects.

Here we present a protocol to investigate the effect of the nullification of gustation-related genes on immune responses in a dextran sulfate sodium (DSS)-induced inflammatory bowel disease (IBD) mouse model.

Auswirkungen des Geschmacks Signalisierung Protein Abschaffung auf Darm-Entzündung in eine entzündliche Darm-Krankheit-Maus-Modell

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

Die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell für verbreitet Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...