Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse für BAV von der Morbus Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) und der Canadian Institutes for Health Research (CIHR) unterstützt. GB wurde von einem Diplom-Stipendium aus CIHR finanziert. BAV ist die Kinder mit Darm-und Leber-Erkrankungen (CHILD) Foundation Chair of Pediatric IBD Forschung und Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology.

Ein. Vorbereitung der Citrobacter rodentium Inokulum und orale Gabe von Mäusen <ol><li> Vorbereiten und autoklavieren Luria Bertani Broth (LB). </li><li> Erhalten lebensfähigen C. rodentium aus einem gefrorenen Glycerin Lager und streifenfrei auf LB-Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Pipettenspitze. Bei 37 ° C über Nacht. Beimpfen 3 ml steriler LB Brühe in einen Falken Kultur Rohr mit Kolonien von der LB-Platte mit einer Impföse oder Pipettenspitze. Vorbereitung des Inokulums sollte mit aseptischen Techniken. </li><li> Inkubieren C. rodentium Kultur aerob bei 37 ° C über Nacht in einer Benchtop Inkubationsschüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute. Die beimpften LB-Brühe sollte erscheinen nach Übernacht-Kultur bewölkt. </li><li> Verwenden Sie eine Glühlampe gekippt Magen Magensonde Nadel an einer 1 ml Spritze, jede Maus mit 100 ul der Nacht C. Magensonde rodentium Kultur. Gently scruff der Maus an, indem Sie die lose Haut über seinen Nacken und Rückenmit Daumen und Fingern. Ziehen Sie den Kopf des Tieres mit dem Zeigefinger auf den Kopf fixieren und glätten die Speiseröhre zum Einsetzen der Sonde Nadel. </li><li> Aufrechterhaltung der Maus in einer aufrechten Position und die Glühbirne leiten Spitze der Nadel Magensonde entlang der Seite seiner Öffnung und über seine Zunge. Vorsichtig passieren die Nadel auf dem Dach des Mundes und fördern es durch die Speiseröhre. Wenn es irgendeinen Widerstand zu spüren während dieses Vorgangs, entfernen Sie die Sonde Nadel und legen Sie sie erneut. </li><li> Langsam spritzen 100 ul des bakteriellen Inokulums und entfernen Sie vorsichtig die Magensonde Nadel. Überwachen Sie die Atemfrequenz und das Verhalten der Maus nach Rückgabe an seinem Käfig. </li></ol> Notes: <ul><li> In den Schritten 2 und 3, ferner einen falcon Kulturröhrchen unter aseptischen Bedingungen mit 3 ml sterile LB Brühe über Nacht kultiviert werden, um sicherzustellen, dass es keine bakterielle Verunreinigung der Brühe selber. Die LB-Brühe sollte erscheinen nach Übernacht-Kultur deutlich. </li><li&gt; vorsichtig geschwenkt die Kultur innerhalb des Falcon-Röhrchen vor dem Laden Spritzen für Magensonde so daß eine gleiche Dosis von Bakterien an jeder Maus geliefert wird, in Schritt 4. </li><li> Übernacht-Kultur zu verwerfen, wenn sie für mehr als 24 Stunden geimpft werden. </li><li> Alle C. rodentium Infektionen und Gehäuse von infizierten Tieren sollte in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt werden. </li></ul> 2. Mess Kolonepithelzellen Barrier Durchlässigkeit in C. rodentium-infizierte Mäuse <ol><li> Messen Barriere Integrität bei einem gewünschten Zeitpunkt nach der Infektion. </li><li> Am Tag des Assays, bereiten genug 4 kDa Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 80 mg ml -1 jede Maus mit 150 ul Magensonde und die Standard-Kurve zu erstellen. </li><li> Scruff die Maus und die Magensonde mit 150 ul FITC-Dextran. Zurückzuziehen Lebensmittel aus dem Käfig zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Anesthetize Mäusen 4 h nachgavaging und sammeln Sie so viel Blut wie möglich (~ 450 ul) durch Herzpunktion. Fügen Sie das Blut bis zu einer Endkonzentration von 3% Säure-Citrat-Dextrose in einem Mikrozentrifugenröhrchen zur Gerinnung zu verhindern. Euthanize die Mäuse und sammeln Kolon Geweben in PBS für Keimzahlen (Schritte 3.1 - 3.5) und in 10% Formalin für Gewebefixierung und letztlich Immunfluoreszenzfärbung (Schritte 4,1 bis 4,8). </li><li> Drehen Sie die Blutproben bei 1.000 xg für 12 min in einer Zentrifuge bei 4 ° C. Das Serum und mit Wasser auf 1/10 und 1/100 in PBS. Je 100 ul jeder Probe an diesen beiden Verdünnungen in eine 96-Well-Platte in repliziert. </li><li> Um den Standard-Kurve zu erstellen, verdünnen das Original 80 mg ml -1 FITC-Dextran verwendet, um die Mäuse in PBS zu den folgenden Konzentrationen Magensonde: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 und 0 ug / ml . Fügen Sie 100 ul von jeder Konzentration auf eine 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Quantifizierung der Fluoreszenz von jeder Probe unter Verwendung eines Fluorometer bei einer Anregungswellenlänge wavelength von 485 nm und 535 nm Emissionswellenlänge. </li><li> Analysieren Sie die Rohdaten durch Auftragen der Standardkurve. Eingangs der Rohdaten für jede Probe in die Gleichung der Geraden durch die Standardkurve erzeugt werden, um die Konzentration von FITC-Dextran in jeder Probe zu bestimmen. </li></ol> Notes: <ul><li> Vom Schritt 4 weiter, halten Blutproben auf Eis und Minimierung der Exposition gegenüber Licht. </li><li> Beim Messen Epithelbarriere Integrität ein Zeitpunkt, bei, oder vor, beträgt 7 Tage nach der Infektion optimal, da schwere Gewebeschädigung beginnt, sobald dieser Stelle. Mess-Barriere Integrität vor schweren Schäden können Sie maximal Unterschiede in Durchlässigkeit während C. bestimmen rodentium Infektion zwischen Mausstämmen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass infizierte Kontrollmäuse sind auch für epitheliale Barriere Integrität getestet. </li></ul> 3. Messung der bakteriellen Belastung in Geweben von C. rodentium-infizierte Mäuse <ol><li> 1 ml steriler PBS einnd ein autoklaviert Metallsicke zu einem runden Talsohle 2 ml Zentrifugenröhrchen unter aseptischen Bedingungen. Einzelnen Geweben von jedem Tier gesammelt werden, in separaten PBS Röhren platziert werden. Wiegen die Röhren vor der Zugabe des Gewebes. </li><li> Entfernen Sie den Blinddarm und Dickdarm von der Maus. Trennen Sie den Blinddarm aus dem Darm und verdrängen die luminalen Inhalte mit einer Pinzette. Fügen Sie den Inhalt in einen PBS Röhre. Nach der Trennung 0,5 cm große Stücke aus der distalen Dickdarm und Blinddarm für 10% Formalin-Fixierung, schnitt den restlichen Dickdarm und Blinddarm längs und waschen mit sterilem PBS, bevor Gewebe in Röhren. </li><li> Wiegen die PBS Röhrchen mit dem Gewebe und anschließend homogenisieren der Proben unter Verwendung einer Kugelmühle für 6 min bei 30 Hz liegt. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen, fügen Sie 180 ul sterilem PBS pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Fügen Sie 20 ul jeder homogenisierte Probe in die erste Vertiefung in jeder Zeile. Gut mischen und seriell verdünnen, Zugabe von 20 ul von jeder vorherigen gut Verdünnungen von 10 -1 erhalten (wir zuerstll) bis 10 -6. Plate 10 ul jeder Verdünnung von jeder Probe in dreifacher Ausfertigung auf einem quadratischen unteren LB-Platte mit einem Gitter. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Graf Kolonie bildenden Einheiten (KBE), dann der Mittelwert der 3 zählt, und notieren Sie die Verdünnung, bei der jede Probe wurde gezählt. Multiplizieren durchschnittliche CFU von 50, wie 20 ul der ursprünglichen 1 ml Probe verwendet wurde, und durch den Verdünnungsfaktor, bei der die Probe gezählt resultierende in KBE / ml wurde. Schließlich teilen sich durch das Gewebe Gewicht KBE / g zu bestimmen. </li></ol> 4. Histologische Beurteilung und Immunfluoreszenzfärbung von Infected Colon Tissues <ol><li> Collect Geweben, wie in Schritt 3.2. Shop Geweben in Formalin über Nacht, dann mit 70% Ethanol waschen. Einbetten Gewebe in Paraffin und schneiden 5 &amp;mgr; m-Schnitte für die Färbung. Stain mit Hämatoxylin &amp; Eosin für die histologische Beurteilung und fahren Sie mit den folgenden Schritten für Immunfluoreszenzfärbung. </li><li> Um Gewebe vor der Färbung Entparaffinieren, gleitet ineine Coplin Färbeküvette und legte in 65 ° C Wasserbad für 10 min. Weiter, Objektträger in Xylol für vier Wäschen jeweils 2 Min. 95% Ethanol, 75% Ethanol und dH 2 0: Objektträger dann mit zwei 5-minütigen Waschungen in 100% Ethanol, um einen 5 min Waschschritt in jedem der folgenden gefolgt rehydratisiert werden. Diese Wäschen sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um die Exposition gegenüber schädlichen Dämpfen zu vermeiden. </li><li> Objektträger in die Coplin mit vorgewärmter Natriumcitratpuffer und anschließend in einen Dampfer für 30 min, dann lassen Sie sich für 30 min. Dieser Prozess bricht die Protein-Vernetzungen durch Formalinfixierung Wiedergewinnen potentielle antigene Stellen gebildet. </li><li> Waschen mit PBS für 5 min Azid, dreimal. Dry Dias und mark Umgebung Gewebe mit einem PAP Stift eine hydrophobe Barriere zu schaffen, halten die Färbereagenzien auf das Gewebe lokalisiert. </li><li> Block Gewebe für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Blocking-Puffer (z. B. α-Ziegenserum) in einer feuchten Kammer Immunfärbung. </li><li> Verdünnen primary Antikörper gewünschten Konzentration mit Antikörperverdünnungspuffer. Abgießen Blocking-Puffer und fügen 50-100 ul des primären Antikörpers an Geweben. Inkubieren bei 4 ° C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Waschen mit PBS für 5 min Azid, dreimal. Hinzufügen von 50 bis 100 ul sekundären Antikörper in Verdünnungspuffer Antikörpers an das Gewebe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln verdünnt. Waschen mit dH 2 O für 5 Min., dreimal. </li><li> Entwässern Folien, fügen DAPI verlängern Gold-Eindeckmedium und Deckglas. Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> Notes: <ul><li> PBS-Azid kann mit frisch zubereiteten PBS als Alternative zu bakteriellen Wachstums in dem Waschmedium aus Schritt 4 weiter substituiert sein vermeiden. </li></ul>

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	<li>Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).</li><li>Cario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+Receptors+in+Inflammatory+Bowel+Diseases:+A+Decade+Later.">Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).</li><li>Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Animal Models of Inflammatory Bowel Disease.</a> Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Luperchio, S., Schauer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Citrobacter+rodentium+and+transmissible+murine+colonic+hyperplasia.">Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia.</a> Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).</li><li>Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+host+responses+to+enteric+bacterial+pathogens:+a+balancing+act+between+resistance+and+tolerance.">Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance.</a> Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).</li><li>MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+defences+to+Citrobacter+rodentium.">Host defences to Citrobacter rodentium.</a> International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).</li><li>Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+the+Citrobacter+rodentium+infection+model+in+laboratory+mice.">Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).</li><li>Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+plays+a+critical+role+in+maintaining+mucosal+integrity+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis.">Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).</li><li>Dennis, A., Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p50+subunit+of+NF-&#954;B+is+critical+for+in+vivo+clearance+of+the+non-invasive+enteric+pathogen+Citrobacter+rodentium.">The p50 subunit of NF-&#954;B is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).</li><li>Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+signalling+plays+a+critical+role+in+host+defence+by+controlling+pathogen+burden+and+promoting+epithelial+cell+homeostasis+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis.">MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).</li><li>Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signaling+mediated+by+MyD88+is+required+for+a+protective+innate+immune+response+by+neutrophils+to+Citrobacter+rodentium.">TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium.</a> Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).</li><li>Bry, L., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+T+cell+dependent+serum+antibody,+but+not+the+gut-associated+lymphoid+tissue,+for+surviving+acute+mucosal+infection+with+Citrobacter+rodentium,+an+attaching+and+effacing+pathogen.">Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).</li><li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4++T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li><li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt/&#946;-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and/or+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection.">Critical Roles of Notch and Wnt/&#946;-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection &amp; Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Citrobacter rodentium Infektion stellt ein geeignetes Modell für die Untersuchung von sowohl infektiösen Krankheit und Colitis bei Mäusen. Diese einzigartige Modell erlaubt die Charakterisierung von Host Reaktionen sowie der pathogenen Eigenschaften der Bakterien. Die beschriebenen Schritte in diesem Protokoll detailliert die erfolgreiche Anwendung dieses Modells. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll im Auge zu behalten, wenn induzieren ulcerosa und Analyse Antwo...

Infektion durch enterale bakterielle Erreger löst gastrointestinale (GI) Entzündungen sowie Darm-Pathologie und Pathophysiologie, einschließlich Durchfall und Darm-epitheliale Barriere Dysfunktion. Die Virulenz Mechanismen, durch die bakteriellen Erreger besiedeln den GI-Trakt der Gastgeber, sowie spezielle Host-Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen schlecht verstanden werden, haben jedoch Fortschritte in der Modellierung von enterischen bakterielle Infektionen begonnen, unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Die IBDs Morbus Crohn (CD) und UC sind komplexe Erkrankungen unbekannter Ätiologie, die durch chronische Darm-Entzündung und Gewebeschädigung gekennzeichnet. Viele Mausmodellen Darmentzündung existieren, durch spontane Entzündung in genetisch modifizierten Stämme wie IL10 - / - Mäuse, um chemische Herausforderungen mit Verbindungen, wie Dextran Natriumsulfat (DSS) und dinitrobenzene sulfonsäure (DNBS) 1. Es wurde vermutet, dass die Fehlanpassung chronischen Entzündungsreaktionen in IBD-Patienten bei genetisch vorbelasteten Individuen entwickeln bei einem abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Enterobakterien 2, also in der Studie von Modellen von infektiöse Kolitis auch signifikante Möglichkeit der Festlegung von potentiell pathogenen Host . Reaktionen auf Enterobakterien Citrobacter rodentium induzierte Colitis ist eines der seltenen Modelle infektiöse Kolitis, aber gut 1,3 dadurch, so dass für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien und weiteres Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese; ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung neuartiger präventiven und therapeutischen Behandlungen. C. rodentium ist ein Anbringen und gramnegative Effacing (A / E), Murines spezifischen bakterielles Pathogen, das eng mit dem wichtigen menschlichen zusammenhängtPathogene enteropathogenen E. coli (EPEC) und enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) 3-8. Die Familie von A / E Pathogene innig an die apikale Wirtszellmembran der Blinddarm und Kolonepithel befestigen, Bilden einer nicht-invasiven sockelartigen Struktur auf der Wirtszelle. Oral Herausforderung mit C. rodentium von 10 8 -10 9 Organismen produziert eine robuste Ausführung der infektiöse Kolitis durch die mikrobielle Hyperplasie oder Dehnung der Krypten, einkernigen Immunzelle Infiltration und Becherzellen Zelldepletion 3,4 charakterisiert. Der Ort der ersten Besiedlung, ein paar Stunden nach Herausforderung, an der Blinddarm Patch, gefolgt von Progression zu distalen Kolon 2 bis 3 Tage nach der Infektion 3. Bei immunkompetenten Maus-Stämmen ist Clearance des Erregers 3 bis 4 Wochen nach der Infektion 1,3,4 erreicht. Allerdings sind viele genetisch veränderte Stämme, zB Gen defizient oder Knockout-(- / -)-Mäusen wurden, gefunden worden, um anzuzeigen Increased Infektionsanfälligkeit was zu Schäden übertrieben und / oder chronischen Infektion und Entzündung 9-14. Mit der Benutzung dieser infektiöse Kolitis Modell in dieser Knockout-Stämme, viele fehlen angeborenen Signalproteine, wurde bei der Aufdeckung mehrerer Wirtsproteinen integraler Bestandteil Auflösung von Darm-Infektion und Entzündung unverzichtbar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Luria Broth </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Fügen Sie 25 g LB Pulver 1L Wasser. Autoklavieren vor dem Gebrauch. </td></tr><tr><td> Platz Bodenplatte mit Gitter </td><td> Fischer </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr><tr><td> Falcon Kulturröhrchen </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Bulb gekippt Magen Magensonde Nadel </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Spritze </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-Dextran </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> Zitronensäure </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Natriumcitrat </td><td> Fischer </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> Fischer </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Saurem Citrat Dextrose </td><td></td><td></td><td> 20 mM ctiric Säure, 110 mM Natriumcitrat, 5 mM Dextrose </td></tr><tr><td> Schwarze 96-Well-Platte </td><td> Fischer </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Metallperlen (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Formalin </td><td> Fischer </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Flasche </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> Fischer </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> Fischer </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xylol </td><td> Fischer </td><td&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin Färbeküvette </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitratpuffer </td><td></td><td></td><td> 10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Pap pen </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> Ziegenserum </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> Fischer </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> Blocking-Puffer </td><td></td><td></td><td> 2% Ziegenserum, 1% BSA, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% NatriumazidAzid, 0,01 M PBS, pH 7,2, Mix &amp; Standort bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Antikörperverdünnungspuffer </td><td></td><td></td><td> 0,1% Triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% Natriumazid, 0,04% EDTA </td></tr><tr><td> Blockpuffer &amp; Antikörper Verdünnungspuffer für tir </td><td></td><td></td><td> Gleichen Rezepte wie oben, jedoch ohne Zusatz von Reinigungsmitteln (Triton X-100 und Tween 20) </td></tr><tr><td> Verlängern Gold-Antifade Reagenz mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36.931 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Fischer </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop Inkubationsschüttler </td><td> Barnstead Lab Line </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorometer </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Kühlzentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td> Dampfer </td><td> Black &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um ein robustes Modell von Infektionskrankheiten und Colitis zu produzieren, sowie die Methoden zur Citrobacter rodentium Infektion in Mäusen zu charakterisieren. C. rodentium ist ein gram-negative, murine bestimmte bakterielle Erreger, die eng mit der klinisch wichtige menschliche Krankheitserreger enteropathogenen E. verwandt ist coli und enterohämorrhagischen E. coli. Nach Infektion mit C. rodentium, immunkompetenten Mäusen leiden bescheiden und vorübergehende Gewichtsverlust und Durchfall. Histologisch sind Darm-crypt Dehnung, Immun-Zell-Infiltration und Becherzellen Zell-Depletion beobachtet. Clearance der Infektion wird nach 3 bis 4 Wochen erreicht. Messung der intestinalen Epithelbarriere Integrität, bakterielle Belastung und histologische Schäden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion, erlauben die Charakterisierung von Mausstämmen anfällig für Infektionen. Die Virulenz Mechanismuss mit dem bakteriellen Erreger besiedeln den Darm ihrer Wirte sowie bestimmten Host Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen sind weitgehend unverstanden. Deshalb ist die C. rodentium Modell enterischen bakterielle Infektion dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Es wurde vermutet, dass die maladaptive chronischen Entzündungsreaktionen bei CED-Patienten gesehen, bei genetisch anfälligen Personen nach abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Darmbakterien zu entwickeln. Daher bietet die Studie von Modellen von infektiöse Kolitis erhebliches Potential zur Definition potentiell pathogenen Host Reaktionen auf Enterobakterien. C. rodentium induzierte Colitis ist eine solche seltenen Modell, das für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien ermöglicht,, das Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese;essentiell für die Entwicklung von neuartigen präventiven und therapeutischen Behandlungen.

Während einer Standard-Infektion Experiment werden Mäuse mit ca. 2,5 x 10 8 CFU durch eine Magensonde von 100 ul Nacht C. infiziert rodentium Kultur. Infektion von C57BL / 6 Mäusen mit C. rodentium Ergebnisse in bescheidenen und vorübergehenden Gewichtsverlust und Durchfall. Obwohl ein seltenes Ereignis mit C57BL / 6 Mäusen, können die Tiere krank werden und erfordern Euthanasie. Daher sollten Mäusen Grad der Gewichtsverlust und Symptome von Stress, wie piloerect Fell und gek...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.

Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K Aufrufe.  BC Children's Hospital. Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.

Serie: The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...