Wir haben eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Extraktion der genomischen DNA von C.elegans entwickelt, die sich hervorragend für Unterrichts- und Forschungsanwendungen eignet. Diese Protokolle können zuverlässig verwendet werden, um DNA-Vorlagen aus einer einzigen oder einer kleinen Probe von C.elegance für PCR-basierte Anwendungen schnell herzustellen. Benutzer, die keine Erfahrung mit dem Pflücken von Würmern oder der Verwendung eines Mikropipetters haben, können mit Schritten kämpfen, die diese Fähigkeiten erfordern.
Einen erfahrenen Praktiker zu beobachten und zu üben, kann helfen. Das Verfahren wird Farhan Lakdawala, ein Senior-Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Um DNA aus einem einzelnen Caenorhabditis elegans-Wurm zu extrahieren, stellen Sie zuerst das Lyseprogramm ein, das aus einem Zyklus bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten besteht, gefolgt von 95 Grad Celsius für drei Minuten in einem Thermocycler.
Um die Lyselösung vorzubereiten, fügen Sie zunächst 0,8 Mikroliter Extraktionslösung aus dem Kit an die Innenwand eines 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens auf Eis hinzu. Dann fügen Sie 0,2 Mikroliter Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung hinzu und mischen Sie es durch Streicheln. Bei der Auswahl eines Wurms für die DNA-Extraktion identifizieren Sie zunächst ein L4- oder erwachsenes Tier unter einem Seziermikroskop.
Ein L4-Hermaphrodit kann durch eine charakteristische Vulva identifiziert werden, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Um einen erwachsenen Hermaphroditen zu identifizieren, wählen Sie eines der größten Tiere auf der Platte aus, das ovale Embryonen in seiner Gebärmutter sichtbar haben kann. Als nächstes übertragen Sie das ausgewählte Tier mit einem Platin-Drahtbesteck in die Lösung.
Um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln, zentrifugieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur. Legen Sie dann die Röhre in den Thermocycler und führen Sie das zuvor eingestellte Lyseprogramm aus. Nachdem dieses Lyseprogramm beendet ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis.
Dann fügen Sie 0,8 Mikroliter Neutralisationslösung aus dem Kit hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren. Auch hier zentrieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur. Wenn das Lysat nicht sofort verwendet wird, lagern Sie das Rohr bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung.
Um DNA aus einem einzelnen Würmer zu extrahieren, stellen Sie zuerst das Lyseprogramm eines Zyklus auf 55 Grad Celsius für 10 Minuten ein, gefolgt von 95 Grad Celsius für drei Minuten in einem Thermocycler. Als nächstes bereiten Sie die Lyselösung vor, indem Sie zuerst zwei Mikroliter der Extraktionslösung aus dem Kit an die Innenwand eines 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens auf Eis geben, gefolgt von der Zugabe von 0,5 Mikrolitern der Gewebepräparationslösung aus dem Kit zum Tröpfchen der Extraktionslösung, dann mischen Sie den Inhalt durch Pipettieren. Nachdem Sie L4 oder erwachsene Tiere identifiziert haben, verwenden Sie einen Platin-Drahtpicker, um eine ausreichende Anzahl von Tieren in die Lösung zu übertragen.
Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur, legen Sie dann das Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das zuvor eingestellte Lyseprogramm aus. Nach Abschluss des Programms das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf Eis legen. Dann zwei Mikroliter der Neutralisationslösung aus dem Kit in das Rohr geben und durch Pipettieren mischen.
Auch hier zentrieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur. Wenn es nicht sofort verwendet wird, lagern Sie das Lysat bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Die genomische DNA, die durch das Protokoll extrahiert wurde, konnte erfolgreich als PCR-Vorlage verwendet werden, sowohl das kommerzielle Kit als auch die traditionelle Proteinase-K-Methode produzierten DNA mit ähnlichen PCR-Amplifikationsstufen eines 2100-Basenpaar-Produkts und eines 500-Basenpaar-Produkts.
Die Kit-Methode für die DNA-Lyse lieferte auch PCR-Vorlagen, die für eine Vielzahl von DNA-Polymerase-Enzymen wirksam sind. Selbst bei verschiedenen Verdünnungen unterstützte die DNA, die von einem einzigen Tier durch das kommerzielle Kit extrahiert wurde, die PCR-Amplifikation eines 2100-Basenpaar-DNA-Fragments mit gleichwertiger Effizienz. Die Amplifikation eines DNA-Fragments mit 500 Basenpaaren variierte jedoch mit der Vorlagenkonzentration.
Die Eignung der DNA, die entweder von einem einzelnen Tier oder von mehreren Tieren als PCR-Vorlage zur Bestimmung des Genotyps extrahiert wurde, wurde durch die erfolgreiche Amplifikation eines Gens und seiner mutierten Variante weiter nachgewiesen. Da dieses Protokoll das Pipettieren kleiner Mengen von Reagenzien beinhaltet, verwenden Sie zur Sicherstellung der Konsistenz eine Mastermischung für mehrere Reaktionen, eine gute Rohrleitungstechnik und gut kalibrierte Pipetten. Auch das Drehen des Inhalts des Röhrchens sorgt für eine ordnungsgemäße Lyse.
Diese Methode könnte ausgeweitet, angepasst werden, um genomische C.elegans-DNA für andere nachgelagerte Anwendungen zu extrahieren, und könnte verwendet werden, um DNA von anderen Nematodenarten zu extrahieren. Angesichts der Einfachheit, Geschwindigkeit, Robustheit und niedrigen Kosten des Protokolls eignet es sich sowohl für Forschungs- als auch für Klassenzimmeranwendungen, bei denen Zeit und Ressourcen begrenzt sind.
