Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01DA021194 und R01NS058850 unterstützt.

1. Hirnschnitt Vorbereitung <ol><li> Junge (15-40 Tage alt) männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten verwendet. (Wir verwenden auch diese gleiche Protokoll bei Mäusen.) Unter tiefen Urethannarkose, sind Tiere geköpft und das Gehirn ist schnell herauspräpariert. Dann werden 300 Mikrometer dicke koronalen Hirnschnitten mit den midrostral Teil der Substantia nigra sind auf einer Leica Vibratom (VT-1200S) geschnitten. 220 Saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D-: Die Scheibe schneiden Vorgehensweise ist in einem eiskalten, sauerstoffreiches hohen Saccharose Schneiden Lösung (in mM) durchgeführt Glukose. Es ist mit einer Mischung aus 95% O 2 / 5% CO 2 zu halten Sauerstoff und zu pflegen pH bei 7,4 sprudelte. Halten Sie das Schneiden Lösung eiskalten während des gesamten Verfahrens. </li><li> 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 10: Die Hirnschnitten in einer Inkubationskammer mit einer oxygenierten künstlichen Liquor (aCSF) enthält (in mm) gefüllt inkubiert D-Glucose. Es ist mit einer Mischung aus 95% O 2 / 5% CO 2 zu halten Sauerstoff und zu pflegen pH bei 7,4 sprudelte. Die Inkubationszeit beträgt 34 ​​° C für 45 min und anschließend bei Raumtemperatur bis zum Hirnschnitt, um die Aufnahme Kammer übertragen wird. </li></ol> 2. Elektrophysiologische Fingerabdrücke nigral Neuronen <ol><li> Ein Hirnschnitt ist es, ein Patch-Clamp-Aufzeichnung Kammer kontinuierlich mit dem Sauerstoff aCSF bei 32 ° C perfundiert übertragen </li><li> Patch-Pipetten sind aus Borosilikatglas autoklaviert (KG-33) Glaskapillare Schlauch (1,10 mm ID, 1,65 mm od, King Precision Glass, Claremont, CA) mit Hilfe eines PC-10-Abzieher (Narishige, Tokyo, Japan) gezogen und mit intrazellulären Lösung vorbereitet mit DNase-RNase-freies Wasser (Fisher Scientific) (mit 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl 2, pH-Wert auf 7,3). Die Patch-Pipetten haben Widerstände von 2-3 MOhm in der Badewanne. </li><li> Die Substantia nigra ist nach seiner ausgeprägten anatomischen Lage (Abb. 1A1-2) identifiziert. Unter visuelle Führung eines Video-Mikroskops (Olympus BX51W1) mit Nomarski Optik und 60X Wasser Immersionslinse, große Zellen in der Substantia nigra pars compacta (SNC) und die Substantia nigra pars reticulata ausgestattet (SNR) (möglichst DA Neuronen und GABA Neuronen) sind ausgewählt für die Aufnahme. Konventionelle Giga-Ohm-Abdichtung whole-cell-Konfiguration erreicht ist (Abb. 1B1). Stromzange und Voltage-Clamp-Analysen durchgeführt werden können. Zur Minimierung der mRNA-Abbau, sollten elektrophysiologische Ableitung kurz sein (≤ 5 min). Eine Möglichkeit ist, nur die Membran und spiking Eigenschaften Datensatz elektrophysiologischen Fingerabdrücken zum Zwecke der Neuronen Interessen (Abb. B2-3) liefern. Diese kurze Aufzeichnung dauert nur ca. 1 min. </li></ol> 3. Zytoplasma Aspiration <ol><li> Nach elektrophysiologischen Fingerprinting und Charakterisierung von SNr GABA und DA Neuronen, ist sanft Mund Absaugen angewendet, um das Zytoplasma absaugen. Der Zellkern kann auch abgesaugt werden, was in der genomischen DNA-Kontaminationen. Die Abdichtung sollte nicht gebrochen werden, sonst extrazelluläre Ablagerungen einschließlich mRNA kann in der Patch-Pipette angesaugt werden und verunreinigen den Inhalt der Zelle. Die Integrität der Abdichtung ist gut, solange der Anstieg in den Haltestrom bei -70 mV nicht mehr als 100 pA. </li><li> Dann wird die angesaugte Zellinhalt wird in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen durch das Brechen der Pipettenspitze und einem kleinen Überdruck vertrieben. Eine Zelle der Inhalt wird in ein PCR-Röhrchen gesammelt. Nach der Übernahme des Zellinhalts, das Sammeln PCR-Röhrchen auf Eis vorgekühlt, wird sofort in einem -20 ° C Gefrierschrank gelegt. </li><li> Um eine Kontamination der extrazellulären Ablagerungen, die mRNAs enthalten kann, ist der Patch-Pipette in das Gewebe, ohne tatsächlich Absaugen Zytoplasma abgesenkt und dann die Pipette Inhalt wird auf RT-PCR unterzogen. </li></ol> 4. Reverse Transkription (RT) <ol><li> Nach dem Sammeln Zellinhalt von einer angemessenen Anzahl von Neuronen, in der Regel 10-20, sollten RT sofort damit beginnen, den Abbau von mRNAs zu minimieren. </li><li> Da die Menge der Zellinhalt aus einem einzigen Neuron zu klein ist, ist die RNA-Isolierung Verfahren nicht durchgeführt. So entfernen Sie das Potenzial kontaminierende genomische DNA wird die angesaugte Zellinhalt zuerst von DNase I (5 ul DNase I und 1,6 ul DNase I Puffer, 5 min bei 25 ° C) verdaut. Dann DNase I wird durch Zugabe von 1,2 ul 25 mM EDTA und Inkubation bei 75 ° C für 5 min inaktiviert. </li><li> cDNA synthetisiert wird mit dem SuperScript III-Reverse-Transkriptase-basierte Cells-Direct cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Tabelle 1). Erststrang cDNA ist bei 50 ° C synthetisiert werden 50 Minuten lang, dann wird die Reaktion durch Inkubation bei 85 ° C inaktiviert 5 min und 1 ul RNase H ist hinzuzufügened zu verdauen mRNA (37 ° C für 20 min). Die einsträngige cDNA wird bei -20 ° C für die spätere PCR-Amplifikation gespeichert. </li><li> Die vollständige Entfernung der genomischen DNA wird durch RT-minus-Steuerung, in der die Reverse Transkriptase weggelassen, während alle anderen Reaktionskomponenten waren genau die gleichen überprüft wird. </li></ol> 5. Zweistufige PCR-Amplifikation <ol><li> Die Primer wurden gemäß der Sequenzen in GenBank konzipiert. Wann immer möglich, wurden Intron-überspannenden Primerpaare verwendet, mit deren Hilfe genomischer DNA-Kontaminationen zu erkennen. Primerpaar Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Wirksamkeit der Primerpaare sollte durch ganze Gehirn mRNAs, die positive Produkte ergeben überprüft werden. Alle Primer werden von Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA) synthetisiert. </li><li> In der ersten Stufe liegt bei 5 ul der 30 ul cDNAs für 35 Zyklen in Gegenwart von Primerpaar (Tabelle 2) verstärkt. Der Temperaturwechsel Protokoll der Thermocycler (Mastercycler, Eppendorf, Tabelle 1) ist 2 min bei 94 ° C für die initiale Denaturierung, dann 35 Zyklen von 15 s bei 94 ° C zur Denaturierung, 30 s bei 55 ° C zu glühen, und 45 s bei 72 ° C zu erweitern, gefolgt von 7 min für eine letzte Verlängerung. Taq DNA Polymerase, Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) und alle anderen notwendigen Komponenten für die PCR-Amplifikation durch eine PCR Super-Mix (Invitrogen, Tabelle 1) zur Verfügung gestellt </li><li> In der zweiten Stufe der PCR wird das Produkt von 1 ul aus der 1. Stufe PCR-Amplifikation als Vorlage verwendet und die gleichen Primerpaar in der ersten Stufe verwendet wird (Tabelle 2). 40 Zyklen werden mit der Erweiterung verkürzt und endet am 30. s. Das gleiche PCR Super-Mix verwendet. </li><li> PCR-Produkte aus der 2. Stufe Verstärkung um 2,5% Agarosegelelektrophorese getrennt sind, visualisiert durch Ethidiumbromid (0,05 mg/100 ml Gel) oder gelgreen unter UV-Licht und fotografiert (Abb. B4). Die positive Bands werden dann ausgeschnitten, extrahiert mit Hilfe eines Qiagen Extraktions-Kits (Tabelle 1) und sequenziert und verglichen mit den veröffentlichten Sequenzen der Zielgene. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Die Dopamin (DA) Neurone in der Substantia nigra pars compacta und pars reticulata und die benachbarten GABA Projektion Neuronen in der Substantia nigra pars reticulata haben unterschiedliche elektrophysiologischen Eigenschaften (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011.). Wie in Abb.. 1B2, zeigen SNr GABA Neuronen hochfrequente spontane spiking rund 10 Hz. Die Spitzen haben eine Basis Dauer ca. 1 ms. Nach hyperpolarisierenden Stromeinspeisung, Anzeige SNr GABA Neuronen eine schwache depolarisierende sag in Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung, was auf eine schwache Expression von I h Strom in diesen Neuronen (Abb. 1B2). Im Gegensatz dazu zeigen die nigral DA Neuronen niedrigen Frequenz (ca. 2 Hz) spontane Spikes, die eine Basis Dauer ca. 3 ms haben. DA Neuronen zeigen auch eine ausgeprägte sag in Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung, was auf eine starke Expression von I h-Strom (Abb. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011). SCRT-PCR mRNA für Glutaminsäuredecarboxylase 1 (GAD1, das Schlüsselenzym für die GABA-Synthese und ein Marker für GABA Neuronen) in elektrophysiologisch identifiziert SNr GABA Neuronen, aber nicht in DA Neuronen (Abb. 1B4, 5). Im Gegensatz dazu erfasst SCRT-PCR mRNA für Tyrosin-Hydroxylase (TH, Schlüsselenzym für Dopamin-Synthese und ein Marker für DA Neuronen) in elektrophysiologisch identifiziert SNc und SNR DA Neuronen, aber nicht in GABA Neuronen (Abb. 1B4, 5). So SCRT-PCR Ergebnisse bestätigen die elektrophysiologischen Neuron Identifikation. Als nächstes wurde SCRT-PCR verwendet, um den Ausdruck der Spannung aktiviert Kv3 Kanaluntereinheiten, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 Profil. Diese Untereinheiten tragen zur spannungsabhängigen K +-Kanäle bilden verschiedener Eigenschaften in Abhängigkeit von Untereinheit Zusammensetzung (Ding et al. 2011). In dem Beispiel SNr GABA Neuron in Abb.. 1B4, mRNAs für Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 nachgewiesen wurden. In dem Beispiel SNr DA Neuronen in Fig.1B5 gezeigt, nur Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 nachgewiesen wurden. In unserem gepoolten Daten wurde Kv3.1 häufiger in SNr GABA Neuronen als in nigral DA Neuronen nachgewiesen, was auf eine höhere Expression von Kv3.1 in den schnell spiking SNr GABA Neuronen (Ding et al. 2011). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> Abbildung 1. Elektrophysiologische Identifizierung SNr GABA Neuronen und nigral DA Neuronen A:.. Nigral Bereiche können durch ihre unterschiedlichen anatomischen Lage identifiziert werden A1 zeigt die Lage der SNC und SNr in einem koronalen Nissl-gefärbten Abschnitt mit einer 1X Ziel eingefangen. Die boxed-Bereich wurde CAPTURed mit einer 10X-Objektiv und in der Mitte, wie durch den Pfeil. Die zellreiche SNc-und Zell-armen SNr sind deutlich sichtbar. A2 zeigt die Lage der SNC und SNr in einer Live, ungefärbten Frontalschnitt mit einem 4X Ziel eingefangen. Die zellreiche SNc-und Zell-armen SNr sind auch eindeutig identifizierbar sein. VTA, ventralen Tegmentum. B1 zeigt eine SNr GABA Neuron als Patch in whole-cell-Modus gespannt. B2 zeigt die typischen elektrophysiologischen Eigenschaften von SNr GABA Neuronen in Stromzange Aufnahmemodus. Diese Neuronen feuern spontan Hochfrequenz Aktionspotential von kurzer Dauer und haben eine schwache I h-vermittelte sag Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung. B3 zeigt die typischen elektrophysiologischen Eigenschaften von nigral DA Neuronen in Stromzange Aufnahmemodus. Sie feuern spontan niederfrequenten Aktionspotentiale von langer Dauer und haben eine herausragende I h-vermittelte Negativfederweg (Pfeilspitze) als Reaktion auf hyperpolarisierenden Stromeinspeisung. So sind SNr GABA Neuronen und nigral Dopamin-Neuronen deutlich elektrophysiologisch. Identifiziert B4 zeigt ein Gel Bild von SCRT-PCR-Produkte von elektrophysiologischen identifiziert SNr GABA Neurons. Glutamat-Decarboxylase 1 (GAD1) ​​mRNA, aber keine Tyrosin-Hydroxylase (TH) mRNA nachgewiesen wurde. mRNAs für Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 wurden in diesem SNr GABA Neuronen nachgewiesen werden. B5 zeigt SCRT-PCR-Nachweis von neuronalen Kv3 Kanal mRNAs in ein SNR DA Neurons. TH-mRNA, aber keine GAD1 mRNA wurde in einem elektrophysiologisch identifiziert SNr DA Neuronen nachgewiesen werden. mRNAs für Kv3.2, Kv3.3 und Kv3.4 wurden in diesem SNr DA Neurons. B6 zeigt gepoolten Daten erkannt. 7. Mögliche falsch-negative und falsch positive Ergebnisse Basierend auf unserer Erfahrung, können verschiedene Faktoren zu falsch-negativen SCRT-PCR Ergebnissen führen. Diese Faktoren schließen Versagen in Absaugen ausreichende Menge des Cytoplasma durch Pipettenspitze Verstopfung, RNase Kontamination und ineffiziente PCR-Primer-Patch. Patch-Pipette Verstopfung kann in der Regel auf dem Videomonitor zu sehen und gekennzeichnet durch einen besseren Zugang Widerstand. RNase Kontaminationen können durch gründliche Deaktivierung und das Tragen von Handschuhen vermieden werden. PCR-Primer Wirksamkeit sollte durch Gesamt-RNA aus einer Hirngewebe Punsch getestet werden (. Zhou et al 2008;. Ding et al 2011). Da wir immer DNase zum ersten behandeln unsere Proben vor der RT, haben wir nicht falsch-positive Ergebnisse auftreten. Theoretisch, ohne DNase-Verdau, hat genomische DNA-Kontaminationen und damit falsch positive Nachweis kann auftreten, wenn das Gen intronlosen oder das Primerpaar nicht überspannen die Intron Region.

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	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Kombination von Patch-Clamp-Aufzeichnung in Hirnschnitt mit SCRT-PCR haben wir gezeigt, hier bieten eine hervorragende Methode, um die mRNA-Expression-Profile für Ionenkanäle, Rezeptoren und Schlüsselenzyme für Neurotransmittersynthese in individuell charakterisiert Neuronen zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich, wenn das Protein in Frage nicht erkannt und lokalisiert werden mit anderen Methoden wie Immunhistochemie durch niedrige Expression und / oder mangels geeigneter Antikörper (Surmeier et al 1996;....

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Key Reagenzien und Geräte <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabelle 2" /> Tabelle 2. Primerpaare für Ratten neuronalen Kv3 Kanal, Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Glutaminsäure Decarboxylase 1 (GAD1) ​​mRNAs für SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

In zentralen Nervensystem von Säugetieren, sind verschiedene Typen von Neuronen mit verschiedenen molekularen und funktionellen Eigenschaften miteinander, nur schwer zu trennen und auch nicht einfach durch ihre Morphologie identifiziert vermischt. So ist es oft schwierig, die Genexpression in einem bestimmten Neuron Art zu analysieren. Hier dokumentieren wir ein Verfahren, whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmetechnik kombiniert mit Single-Cell-Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (SCRT-PCR) zum Profil mRNA-Expression in verschiedenen Typen von Neuronen in den wesentlichen nigra. Elektrophysiologische Techniken werden zuerst auf die neurophysiologischen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Nervenzellen aufnehmen. Dann wird das Cytoplasma einzelner elektrophysiologisch charakterisiert nigral Neuronen abgesaugt und einer SCRT-PCR-Analyse zur mRNA-Expression-Profile für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Rezeptoren und Ionenkanäle erhalten. Die hohe Selektivität und Sensitivität machen diese Methode besonders nützlich, wenn Immunhistochemie nicht aufgrund eines Mangels an geeigneten Antikörper oder niedrige Expression des Proteins verwendet werden. Diese Methode ist auch anwendbar auf Neuronen in anderen Hirnregionen.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Neuronen sind zunächst geprägt elektrophysiologisch. Dann das Zytoplasma aus den aufgezeichneten Neuronen wird abgesaugt und einer Transkription-PCR-Analyse umzukehren, um die Expression von mRNAs für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Ionenkanäle und Rezeptoren zu erkennen.

Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Aufrufe.  University of Tennessee College of Medicine. Neuronen sind zunächst geprägt elektrophysiologisch. Dann das Zytoplasma aus den aufgezeichneten Neuronen wird abgesaugt und einer Transkription-PCR-Analyse umzukehren, um die Expression von mRNAs für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Ionenkanäle und Rezeptoren zu erkennen.

Serie: Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...