Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zur Bewertung der endogene LRRK2-Kinase-Aktivität im peripheren Blut des Menschen bereitzustellen. Dies wird durch die Überwachung der LRRK2-vermittelten Phosphorylierung von Rab-Proteinen unter Verwendung von monoklonalen Rab-spezifischen Rab-Antikörpern durch die Michael J.Fox Foundation erreicht. Hier konzentrieren wir uns auf menschliche periphere Blutneutrophile als eine homogene Standortpopulation mit hohen Expressionswerten von Rab2 und Rab10.
Die Neutrophilenisolation basiert auf einer negativen Selektion, die innerhalb von 40 Minuten nach der fertigen Wirkung die Isolierung von 99% reinen und lebensfähigen Neutrophilen ermöglicht und gleichzeitig eine hohe Menge an Proteingehalten ergibt. Sammeln Sie 10 Milliliter Blut in eine Blutentnahmeröhre. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie Rohre sieben- bis achtmal umkehren.
Übertragen Sie 10 Milliliter Blut in eine 50 Milliliter konische Röhre. 100 Mikroliter EDTA-Lagerlösung 1, 0,1 molaren EDTA PBS-Lösung zu Blut hinzufügen, schonend mischen. Fügen Sie 500 Mikroliter Isolationscocktail, 50 Mikroliter pro Milliliter aus dem Neutrophilen-Isolationskit zur Vollblutprobe hinzu.
Wirbeln Sie die magnetischen Perlen aus dem Neutrophilen-Isolationskit für 30 Sekunden vor dem Gebrauch, um sehr feine magnetische Perlen wieder auszusetzen. Fügen Sie 500 Mikroliter magnetische Perlen in die Blutprobe und mischen Sie sanft, indem Sie die Röhre mehrmals invertieren. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren.
Rohr auf 50 Milliliter mit EDTA-Lagerlösung 2 auffüllen. Dies ist eine Millimolar EDTA PBS-Lösung. Mischen Sie durch sehr sanftepipetting auf und ab zwei bis drei Mal.
Legen Sie das Rohr in den Magneten und entfernen Sie den Deckel, um eine nachträgliche Rührung des Rohres zu vermeiden. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sorgfältig pipette angereicherte Zellsuspension, die Neutrophile in einem neuen 50 Milliliter konischen Rohr enthält.
Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt, und vermeiden Sie die Entnahme und Störung der roten Blutkörperchen an der Unterseite des Rohres. Lassen Sie etwa 10 Milliliter der roten Blutkörperchen Suspension am Boden der Röhre. Vortex magnetische Perlen für 30 Sekunden vor Gebrauch und fügen Sie 0,5 Milliliter magnetische Perlen in die Röhre mit den angereicherten Neutrophilen.
Mischen Sie sanft, indem Sie das Rohr invertieren. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Legen Sie das Rohr in den Magneten und entfernen Sie den Deckel, um nachfolgende Rührung zu vermeiden.
Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sorgfältig Pipette die angereicherte Zellsuspension, die Neutrophile in einem neuen 50 Milliliter konischen Rohr enthält. Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt.
Lassen Sie etwa fünf Milliliter der Suspension an der Unterseite des Rohres. Um eine vollständige Entfernung von Magnetperlen aus dem Zellgemisch zu gewährleisten, legen Sie das Rohr mit angereicherten Zellen in den Magneten. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Die angereicherte Zellsuspension, die nun reine Neutrophilen enthält, in einem neuen 50-Milliliter-Konusrohr sorgfältig pipette. Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt. Lassen Sie etwa fünf Milliliter Suspension an der Unterseite des Rohres.
Isolierte Zellen mit einer Millimolar-EDTA-Stammlösung 2 auf ein Endvolumen von ca. 41 Millilitern auffüllen. Pipette nach oben und unten zu mischen. Die Lösung gleichmäßig in zwei Rohre mit ca. 20 Millilitern in jedem Rohr aufteilen.
Zentrifugieren Sie beide Rohre bei 335G für fünf Minuten. Während des Zentrifugationsschritts nehmen Sie MLi-2-Hemmer vor, 200 Mikromolar schneiden 1000X Konzentration aus dem Minus 80 Grad Gefrierschrank und lassen Sie bei Raumtemperatur für die nachfolgende Verwendung. Unmittelbar nach dem Zentrifugationsschritt und ohne Rühren der Schläuche den Überstand abgießen, ohne die neutrophilen Pellets zu stören.
Jedes Zellpellet in 10 Milliliterzellkulturmedium bei Raumtemperatur wieder aufhängen, indem Zellen das Vierfache sanft nach oben und unten geleitet werden. Beschriften Sie ein Rohr DMSO und das andere Rohr MLi-2. Zu DMSO beschrifteten Rohr fügen Sie 10 Mikroliter DMSO und fügen Sie 10 Mikroliter von 200 Mikromolar MLi-2 Stofflösung durch sanfte Pipettierung nach oben und unten zu mischen.
Inkubieren Sie Proben für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Mischen Sie sanft durch Inversion alle 10 Minuten während der Inkubationszeit. Während der 30-minütigen BEHANDLUNG des LRRK2-Kinase-Inhibitors 0,5 Mol DIFP-Stammlösung aus dem Minus 80-Grad-Gefrierschrank entfernen und in Derrauchhaube auf Eis stellen.
Dann bewegen Sie ein Milligramm pro Milliliter Microcystin-LR-Lagerlösung aus dem Minus 80 Grad Gefrierschrank und legen Sie bei Raumtemperatur auf Tauwetter. Einen aliquoten, 0,25 Milliliter des Lysepuffers auftauen, indem man ihn aus dem Gefrierschrank nimmt, bei Raumtemperatur auftauen lassen und dann zur späteren Verwendung auf Eis legen. Bereiten Sie einen Milliliter RPMI-Medium mit einem Mikroliter DMSO vor, nennen Sie diesen DMSO Resuspension Buffer.
Bereiten Sie einen Milliliter RPMI-Medium vor, das einen Mikroliter 200 Mikromolilaren MLi-2 oder alternativen LRRK2-Kinase-Inhibitor enthält, und nennen Sie diesen MLi-2 Resuspension Buffer. Nach der 30-minütigen Inkubationszeit zentrieren beide Röhren wie bisher fünf Minuten bei 335G. Entsorgen Sie den Überstand in jedem Rohr vorsichtig, ohne das neutrophile Pellet zu stören.
Für das DMSO-beschriftete Rohr pellet in einem Milliliter DMSO Resuspension Buffer vorsichtig aufschieben. Und für das MLi-2 beschriftete Rohr, resuspend Pellet in einem Milliliter MLi-2 Resuspension Buffer. Übertragen Sie resuspendierte Zellpellets für drei Minuten auf entsprechende Zentrifugationsröhrchen mit der Bezeichnung DMSO und MLi-2 und Zentrifugen bei 335G.
Bereiten Sie während des Zentrifugationsschritts den Lysepuffer vor. In der Dunstabzugshaube fügen Sie dem 0,25 Milliliter-Lysepuffer vorsichtig 0,25 Mikroliter 0,5-Molaren-DIFP-Lösung sowie 0,25 Mikroliter eines Milligramm pro Milliliter Mikrocystin-LR hinzu. Mischen und auf Eis lassen, bis zum Gebrauch.
Unmittelbar nach der Zentrifugation alle Überstande mit einer Pipette vorsichtig und vollständig entfernen, ohne das neutrophile Pellet zu stören und Rohre auf Eis zu legen. Fügen Sie sofort 100 Mikroliter Lysepuffer mit DIFP und Microcystin-LR in jedes Rohr. Mit einer 100- bis 200-Mikroliter-Pipette die Zellpellets wieder aufheben, indem Sie etwa fünf- bis zehnmal nach oben und unten pfeifen.
Liegen Sie Zellen für 10 Minuten auf Eis. Dann Zentrifugenrohre bei 20.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellablagerungen zu entfernen. ÜBERTRAGEN Sie DMSO und MLi-2 Überstand, der neutrophile Lysate enthält, in neue Zentrifugationsröhrchen.
Entsorgen Sie Schuttpellets. Neutrophile Lysate sind nun einsatzbereit oder können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei minus 80 Grad für zukünftige Analysen gelagert werden. Anhand von Daten aus der öffentlich zugänglichen Importdatenbank zeigt diese Grafik, dass eine Fülle der LRRK2- und Rab10-Proteine besonders hoch bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen und Monozyten ist.
Die Isolierung menschlicher peripherer Blutneutrophile mit diesem Verfahren führt zu einer hohen unreinen Ausbeute von Zellen. Die Tabelle oben zeigt die Gesamtzahl der Zellen, die aus 10 Milliliter peripherem Blut von drei gesunden Spendern isoliert wurden. Gezeigt werden auch Reinheit und Lebensfähigkeit der isolierten Zellen sowie die Gesamtproteinlysatausbeute.
Nach der Behandlung mit und ohne den LRRK2-Kinase-Inhibitor werden MLi-2,-Neutrophile in Gegenwart des potenten Protease-Inhibitors DIFP lysiert. Für Abbildung B auf der linken Seite wurden 10 Mikrogramm ganzer Zellextrakte pro Spur einer multiplexquantitativen Immunoblot-Analyse mit den angegebenen Antikörpern unterzogen. Die Abbildung auf der rechten Seite, C, zeigt die Bedeutung des DIFP für die Prävention des proteolytischen Abbaus, insbesondere des großen LRRK2-Proteins.
Im Vergleich dazu sind hohe Konzentrationen von PMSF allein weniger wirksam. Hier zeigt sich, dass die LRRK2-kontrollierte Rab10-Phosphorylierung bei peripheren Blutneutrophilen, die von Patienten mit erblicher Parkinson-Krankheit mit einer heterozygoten VPS35 D620N-Mutation im Vergleich zu Kontrollen stammen, signifikant um das Dreifache erhöht wird. Das obere Diagramm zeigt die Multiplex-Immunoblot-Analyse und den Boden, dessen Quantifizierung.
Dies deutet darauf hin, dass die VPS35 D620N-Mutation den LRRK2-Kinase-Pfad der Aktivität durch einen noch unbekannten Mechanismus aktiviert. Zusammenfassend stellen wir einen einfachen und robusten Test zur Messung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität durch Überwachung der Rab-Proteinphosphorylierung, wie Rab10, in humanen peripheren Neutrophilen vor, diese Methode ermöglicht es uns, die LRRK2-Signalwegaktivität zu bewerten und zu bestimmen, wie Mutationen, Krankheitszustände oder Inhibitoren die LRRK2-Signalwegaktivität modulieren.
