Diese Arbeit wurde von der National Multiple Sclerosis Society unterstützt gewähren RG4595A1 / T auf DD und das NIH / NINDS gewährt NS051470, NS052189 und NS066361 zu KA Figuren und Filme angepasst und / oder nachgedruckt aus Davalos et al., J Neurosci Methods. 2008 Mär 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, mit Genehmigung von Elsevier.

1. Aufbau der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät <ol><li> Bestellen Sie die Narishige STS-A Compact Spinal Cord Klemmen und die Narishige MA-6N Head Holding-Adapter. </li><li> Individuelles Design und einen Edelstahl-Bodenplatte, die beiden Narishige Teile in Ausrichtung zu halten, so dass der Kopf des Tieres wird unterstützt, während die Wirbelsäule und Schwanz eingeklemmt sind. Denken Sie daran, dass das gesamte Gerät sollte unter dem Mikroskop-Objektiv in der Regel auf eine abgesenkte Mikroskoptisch fit. </li></ol> 2. Tierische Chirurgie <ol><li> Pre-heat dem Mikroskop Kammer mit einer Luftheizung Gerät und halten sie auf 37 ° C. </li><li> Wiegen Sie das Tier und stellen die Narkose-Mix mit 100 mg Ketamin, 15 mg Xylazin und 2,5 mg Acepromazin pro kg Körpergewicht, in 0,9% NaCl-Lösung unter sterilen Bedingungen verdünnt werden. </li><li> Anesthetize das Tier durch Injektion des Anästhetikums Mix (KXA) intraperitoneal. Regelmäßige Zeh kneifen sollte durchgeführt werden, um tiefe Narkose ganz sicher seindas Experiment. Supplement mit der Hälfte der ursprünglichen Dosis stündlich oder nach Bedarf. </li><li> Verwenden Sie ein kleines Tier Heizkissen zur thermischen Unterstützung während der Durchführung des chirurgischen Eingriffs. </li><li> Übernehmen künstliche Tränen Salbe über die Augen, um Hornhaut Austrocknung und Schäden zu vermeiden. </li><li> Shave dem Rücken des Tieres zunächst mit einem Besatz Gerät und dann mit einer scharfen Klinge vollständig zu entfernen Haare aus der Gegend um den Einschnitt. </li><li> Nehmen Sie rasierten Haaren und desinfizieren Sie die rasierte Haut Oberfläche mit einer Alkohol-Pad. </li><li> Führen Sie eine kleine (~ 1,5 cm) Längsschnitt der Haut über den gewünschten spinaler Ebene (Brustwirbel hier abgebildet). </li><li> Expose der Rückenmuskulatur durch vorsichtiges Zurückziehen des subkutanen Bindegewebes. </li><li> Sorgfältig trennen die paravertebralen Muskeln von der Wirbelsäule auf dem gewünschten Niveau. Führen Sie möglichst wenige Schnitte, um die Muskeln von beiden Seiten jeweils Dornfortsatz lösen und dann kratzen die abgelösten MuskelnWeg von der laminaren Oberfläche. </li><li> Wählen Sie die Lamina, die entfernt werden und bereiten den Standorten der Eintrag für die Wirbelsäulen-Klemmen auf jeder Seite der Wirbelsäule, sofort rostral und kaudal der Laminektomie. Sorgfältig verdrängen Muskelgewebe zu vier Taschen, in denen die Klammern eingefügt werden können. </li><li> Heben Sie die Wirbelsäule mit dem geraden Zahn-Spitze Pinzette sichere Einsetzen der gebogenen stumpfen Spitze Schere unter der Lamina ohne sie zu berühren das Rückenmark zu ermöglichen. Führen Sie die Laminektomie durch langsames Schneiden des Knochens auf der einen Seite und dann auf der anderen Seite. </li><li> Verwenden Sie ein Wattestäbchen oder legen vorgeschnitten kleinen Gelschaum resorbierbare Gelatineschwamm Stücke neben den Einschnitten auf kleinere Blutungen zu begrenzen. Mit einem kleinen Schiff cauterizer weitere Blutungen zu kontrollieren, wenn nötig. Verwenden Sie vorgewärmte sterile künstliche Liquor (ACSF), um Gewebe zu waschen. </li></ol> 3. Die Stabilisierung der Wirbelsäule und der Vorbereitung auf in-vivo-Bildgebung <ol><li> Plac<html> e das Tier auf einer Anhöhe Pad auf der Grundplatte der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät und sichern den Kopf in den Kopf halten Adapter. </li><li> Legen Sie die Wirbelsäule Klemmen des STS-A-Gerät entlang der anterior-posterioren Achse des Tieres in die vorbereiteten Taschen flankierenden Laminektomie (Abbildung 1). Die beiden Klemmen sollten in einem Winkel von ~ 45 platziert werden ° gegenüber dem Tier rostro-kaudalen Achse, um genügend Platz für das Absenken eines Wasser Immersionslinse über die freiliegende Rückenmark (Abbildung 1) zu ermöglichen. </li><li> Setzen Sie die dritte Klammer der STS-A-Gerät an der Basis des Schwanzes so dem Körper des Tieres in der Luft kann nach Entfernen der Erhebung Pad für die Dauer der bildgebenden Untersuchungen (Abbildung 1) ausgesetzt werden. </li><li> Bauen Sie ein kleines und von Gelseal (Amersham Biosciences Corp) um den freigelegten Rückenmark zur Aufrechterhaltung des Rückenmarks in ACSF und das Eintauchen des Mikroskop-Objektiv in dieser Lösung in-vivo-Bildgebung zu erleichtern. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. In-vivo-Bildgebung der Maus Rückenmark mit Zwei-Photonen-Mikroskopie <ol><li> Übertragen Sie die Tiere auf der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät in den vorgeheizten Kammer für das Mikroskop und sichern Sie sie auf eine abgesenkte Mikroskoptisch Platzierung des Laminektomie direkt unter dem Objektiv (Abbildung 1). </li><li> Lower eine Wasser-Immersions-Objektiv vorsichtig in das ACSF-Lösung dafür sorgen, dass sie nicht berühren das Rückenmark Klammern oder Gelseal. </li><li> Verwenden Sie Epifluoreszenz, um den Bereich von Interesse zu identifizieren und sich auf sie. Switch to Laser-Scanning-Modus und führen in-vivo-Bildgebung mit den entsprechenden Zwei-Photonen-Laser-Anregungswellenlänge dichroics und Bandpass-Filter für die Fluorophore in dem abgebildeten Gewebe. </li></ol> 5. Repetitive Bildgebung und post-operative Betreuung <ol><li> Am Ende der bildgebenden Untersuchungen, entfernen Sie die Maus aus dem Rückenmark Stabilisierung Gerät und wischen die Gelseal aus der Gegend um die Laminektomie.Reinigen Sie den Bereich gut. </li><li> Wiederherstellen und Naht der Rückenmuskulatur über die Laminektomie. </li><li> Wiederherstellen und Naht der Haut über der Laminektomie, Tupfer mit betadine. </li><li> Geben Sie 1 ml Ringer-Laktat-Lösung (Baxter Healthcare) als Nährstoff-und Flüssigkeitszufuhr zu ergänzen, sowie analgetische Behandlung subkutan (0,1 mg / kg Buprenorphin). </li><li> Verwalten antiseptische Behandlung intraperitoneal (0,03 ml pro Maus, 2,27% Enrofloxacin injizierbaren antibakteriellen Lösung). </li><li> Legen Tier auf einem Heizkissen bis zur vollständigen Erholung aus der Narkose und anschließend Haus ist individuell. </li><li> Wiederholen Sie die antiseptische Verwaltung täglich für die ersten 3-5 Tage nach der Operation und analgetische Behandlung alle 8-12 Stunden für 2-3 Tage nach der Operation. Monitor Tier täglich zum normalen Verhalten und vollständige Genesung zu gewährleisten. </li><li> Für Re-Imaging durch die gleiche Laminektomie, öffnen Sie die Naht der Haut und Muskeln und wiederholen Sie die Schritte in den Abschnitten 2 - 4 beschrieben. </li><li> Re-locate dem Vorjahrously abgebildeten Bereich durch das Blut Blutgefäße als eine Karte, wie oben beschrieben 10. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Alle tierischen Verfahren wurden nach den Richtlinien von institutionellen Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der University of California, San Francisco Set durchgeführt und sind in Übereinstimmung mit behördlichen Vorschriften. Ein Bild der spinalen Stabilisierung Gerät und eine schematische Darstellung der Positionierung der Maus auf dem Gerät unter einem Mikroskop-Objektiv ist in Abbildung 1 dargestellt. Unter Berücksichtigung adäquater Raum zum Atmen Bewegungen unter dem Körper des Tieres gewährleistet in-vivo-Bildgebung im Rückenmark stabil. Abbildung 2 zeigt die enge Beziehung zwischen Mikroglia und das Gefäßsystem, wie es war in vivo in das Rückenmark von CX3CR1 GFP / + transgenen Mäusen 18 abgebildet, in die Mikrogliazellen sind endogen mit GFP-markierten. Abbildung 3 zeigt Beispiele für repetitivein-vivo-Bildgebung, wie sie in der gleichen Rückenmarks Bereiche in Mäusen, die ein fluoreszierendes Protein in der Wirbelsäule Axone (YFP-H-Linie 3) und Mikroglia (in der CX3CR1 GFP / + Mäusen) durchgeführt wurde. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" /> Abbildung 1. Stabilisierung der Maus Wirbelsäule in-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. (A) Eine maßgeschneiderte Grundplatte aus Stahl wird verwendet, um die Unterstützung und Ausrichtung der STS-A Narishige kompakte Rückenmark Schraubzwingen und MA-6N Narishige Kopf hält Adapter wie hier gezeigt. (B) Die richtige Positionierung der erwachsenen transgenen Mäuse betäubt mit einer KXA Narkose an der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät. Der Einschub zeigt die Platzierung der Wirbelsäule Klammern unmittelbar rostral und kaudal auf die Laminektomie und die freigelegten Rückenmark. &lt;img alt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. In-vivo-Bildgebung mit hoher Dichte Mikroglia-Zellen und Blutgefäßen in das Rückenmark von narkotisierten Mäusen. Projizierte aber blockfreien z-Stapel (A) sehr dicht GFP-positive Mikroglia (grün) in das Rückenmark eines CX3CR1 GFP / + Maus in der Nähe von Blutgefäßen (rot, beschriftet mit iv-Injektion von Rhodamin Dextran). (B) Hohe Vergrößerung Bild wie in (A) aus einem einzigen Mikrogliazellen an der Wand eines Blutgefäßes mit Prozessen rund um das Schiff verlängert und in Richtung des Rückenmarks Parenchym bezeichnet. Scale-Bars, 10 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repetitive in-vivo-Bildgebung des gleichen axonalen Segmenten und Mikroglia, wie sie verlegt wurden und reimaged in das Rückenmark von anästhesierten Mäusen an verschiedenen Tagen. (A) YFP-lab<html> ELED Axone an den Tagen 0 und 5. (B). Das gleiche vaskuläre Strukturen und Mikroglia-Zellen um sie herum abgebildet in vivo in das Rückenmark von CX3CR1 GFP / + Mäusen an den Tagen 0 und 1. Scale-Bars, 10 um. Movie 1. Representative Zeitraffer-Sequenz in vivo von der Maus Rückenmark erworben. Diese Sequenz zeigt im Detail fein Mikroglia Prozessdynamik (grün) und ihre Wechselwirkungen mit dem Gefäßsystem (rot, beschriftet mit iv-Injektion von Rhodamin Dextran) im Laufe der Zeit innerhalb eines Gewebes dicht mit fluoreszierender Strukturen besiedelt. Die RAW-Bilder waren nur für Hintergrundgeräusche, Helligkeit und Kontrast korrigiert und die Zeitraffer Film wurde von z-Projektion nacheinander erworben Bildstapeln gebaut, ohne Bildausrichtung, durchschnittlich oder z-Auswahl der einzelnen Ebenen. Blutgefäße durchlaufen eine ähnliche Reihe von z Ebenen wie die Bilder von Mikroglia. Z-Ebene Tiefe: 38 um.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov &quot;&gt; Klicken Sie hier, um den Film zu sehen. Movie 2. Timelapse-Sequenz zeigt die rohe Stabilität der bildgebenden Verfahren auf der Ebene eines einzelnen z-Ebene. Schnelle Erfassung der gleichen einfachen z-Ebene in das Rückenmark von CX3CR1 GFP / + Mäuse an der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät unter KXA Narkose gelegt, zeigt minimal image Verschiebung zwischen aufeinander folgenden Frames bei einer Abtastrate von 1 Bild / s, die schneller ist als die Atemfrequenz der Maus. Der kleine Rest-Verschiebung ist wahrscheinlich auf Herzschlag. <a alt="Movie 2" href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2++signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure.">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht einen stabilen und repetitive in vivo Bildgebung von dicht besiedelten fluoreszierende zellulären Strukturen in das Rückenmark von anästhesierten Mäusen mit zwei-Photonen-Mikroskopie. Die erreichte Stabilität ist das Ergebnis einer maßgeschneiderten Wirbelsäulenstabilisierung Gerät und ein Anästhetikum Regime, Atemwegs-induzierte Bewegung Artefakt reduziert. Die Wirbelsäule Stabilisierung Gerät ermöglicht Atempause der Unterseite der Maus Körper und kann mi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Rhodamin B Dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, verdünnt in ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> Ketamin HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC No: 67457-001-10 </td><td> Injizierbare, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> NADA No: 139-236 </td><td> Xylazin injizierbare, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> NADA No: 117-531 </td><td> Injizierbare, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Künstliche Tränen Salbe </td><td> Phönix Pharma- </td><td> NDC No: 57319-760 - 25 </td><td> Schmiermittel </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Fischer </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Schere </td><td> World Precision Instruments </td><td> 555500S </td><td> Gebogen, stumpf-Spitze Schere </td></tr><tr><td> Gerade Pinzette </td><td> World Precision Instruments </td><td> 555047FT </td><td> Zahnriemen Spitze Pinzette </td></tr><tr><td> Kleine Schiffe cauterize </td><td> Feine Science Tools </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc. </td><td> Schwingmühle MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Compact Rückenmark Klemmen </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Head Holding-Adapter </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat- </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. </td><td> NDC No: 12496 - 6757-1 </td><td> Buprenorphin, injizierbare </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacin, antibakterielle injizierbaren 2,27% (20ml) </td></tr><tr><td> Heizkissen - Large </td><td> Feine Science Tools </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy

In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie 1 in Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, um fluoreszierende Proteine ​​in bestimmten Zelltypen 2-3 hat unsere Kenntnis der physiologischen und pathologischen Prozessen in zahlreichen Geweben in vivo 4-7 erweitert auszudrücken. In Studien des zentralen Nervensystems (ZNS), hat es eine breite Anwendung der in-vivo-Bildgebung des Gehirns, die eine Vielzahl von neuartigen und oft unerwartete Erkenntnisse über das Verhalten der Zellen wie Neuronen, Astrozyten, Mikroglia unter produziert wurde physiologische oder pathologische Zustände 8-17. Allerdings haben vor allem die technischen Komplikationen der Umsetzung der in-vivo-Bildgebung in Studien der lebenden Maus Rückenmark beschränkt. Insbesondere erzeugt die anatomische Nähe des Rückenmarks in die Lunge und das Herz signifikante Bewegung Artefakt, das zur Bildgebung im lebenden Rückenmark eine anspruchsvolle Aufgabe macht. </p&gt; Wir entwickelten eine neuartige Methode, die die inhärenten Grenzen des Rückenmarks Bildgebung überwindet durch die Stabilisierung der Wirbelsäule, wodurch der Atemwege-induzierte Bewegungen und damit die Erleichterung der Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Abbildung der Maus Rückenmark in vivo. Dies ist durch die Kombination eines maßgeschneiderten Wirbelsäulenstabilisierung Gerät mit einer Methode der tiefen Narkose, was zu einer signifikanten Reduktion von Atemwegs-induzierte Bewegungen erreicht. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie man einen kleinen Bereich des Lebendigen Rückenmarks, die unter physiologischen Bedingungen stabil über längere Zeiträume hinweg, indem sie Gewebeschäden und Blutungen auf ein Minimum gehalten werden kann aussetzen. Vertreter von RAW-Bildern erworben in vivo Details in hoher Auflösung die enge Beziehung zwischen Mikroglia und das Gefäßsystem. Ein Zeitraffer-Sequenz zeigt das dynamische Verhalten von Mikroglia-Prozesse in der lebenden Maus Rückenmark. Darüber hinaus zeigen einen kontinuierlichen Scan der gleichen z-frames die herausragende Stabilität, die dieser Methode erreichen können, um Stapel von Bildern und / oder Zeitraffer-Filme, die keine Bildausrichtung nach dem Erwerb zu generieren. Schließlich zeigen wir, wie diese Methode verwendet werden, um erneut und reimage der gleichen Gegend des Rückenmarks zu späteren Zeitpunkten werden, so dass für Längsschnittstudien der laufenden physiologische oder pathologische Prozesse in vivo.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Ein minimal-invasiven Protokoll, um die Maus Wirbelsäule zu stabilisieren und sich wiederholende<em&gt; In vivo</em&gt; Rückenmarks Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist beschrieben. Diese Methode verbindet eine Wirbelsäulen-Stabilisierung Gerät und ein Anästhetikum Regime die Atmungsorgane-induzierte Bewegungen zu minimieren und produzieren Rohstoffe Bilddaten, die keine Ausrichtung oder andere Nachbearbeitung erfordern.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

23.7K Aufrufe.  University of California, San Francisco. Ein minimal-invasiven Protokoll, um die Maus Wirbelsäule zu stabilisieren und sich wiederholende In vivo Rückenmarks Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist beschrieben. Diese Methode verbindet eine Wirbelsäulen-Stabilisierung Gerät und ein Anästhetikum Regime die Atmungsorgane-induzierte Bewegungen zu minimieren und produzieren Rohstoffe Bilddaten, die keine Ausrichtung oder andere Nachbearbeitung erfordern.

Serie: In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...