NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

1. Tiere <ol><li> Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität für Medizin und Zahnmedizin von New Jersey zugelassen. </li><li> Gruppenhaus männlichen C57BL / 6 Mäuse auf einem 12-Stunden-Licht/12 hr dunklen Zeitplan und damit freien Zugang zu Wasser und Nahrung. Sacrifice bei 4-5 Monaten. Euthanasie der Mäuse wurde unter Verwendung der Operationsebene Anästhesie und eine sekundäre Form der Euthanasie (dh dringende Einschnitt in den Brustraum durch die Membran). Dies steht im Einklang mit den Richtlinien AVMA zur Euthanasie. </li></ol> 2. Vorbereitung der Perfusionslösung, Deckgläser, Glaspipetten und Medien <ol><li> Machen 1L Perfusionslösung aus 2,5 mM KCl, 7 mM MgCl 2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM NaHCO 3, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM Glucose, 1 mM Ascorbat, und 3 mM Pyruvat in destilliertem dH 2 O. Stellen Sie die Osmolarität auf ~ 300 mOsm Verwendung von etwa 80 g / l Saccharose. Oxygenat unter Durchblasen mit 95% O 2/5% CO 2 und der pH-Wert auf 7,4. Jedes Experiment wird in etwa 200 ml Perfusionslösung erforderlich. Aliquots bei -20 ° C für bis zu 2 Monate gelagert werden. </li><li> Stellen Sie 250 ml Neurobasal Lager enthält Neurobasal Medien ohne Glucose, 2,5 mM Glucose und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. Stellen Sie die Osmolarität der Neurobasal Lager bis 280 mOsm mit Saccharose. Stellen Sie 500 ml enthält Hibernate Hibernate Lager-A-Medium ohne Glucose, 2,5 mM Glucose und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Rühren Sie beide Aktien gut und Filter sterilisieren mit Stericup Vakuumfiltereinheiten. Seien Sie vorsichtig, nicht zu Glucose oder anderen Verunreinigungen durch die Glaswaren oder Rührstäbe einzuführen. Wickeln die Flaschen in Folie, die Medien vor Licht zu schützen und bei 4 ° C für bis zu 2 Monate. </li><li> Flamme die Spitzen der vier autoklaviert Glaspipetten (9), so dass die Spitzen nicht longer scharf und der Öffnungsdurchmesser sind groß (~ 0,9 mm), mittelgroße (~ 0,7 mm), mittel (~ 0,5 mm) und kleine (~ 0,3 mm). Der größte ist kaum poliert werden und die kleinste sollte ungefähr ein Drittel dieses Durchmessers sein. </li><li> Am Tag vor der Ernte Neuronen, sauber vier 25 mm Deckgläschen mit 70% Ethanol und das über eine Bunsenbrenner-Flamme. Legen Sie jedes Deckglas in einem sterilen 35 mm Kulturschale und 2 ml steriler 1% Poly-D-Lysin in dH 2 O. Legen Sie die Speisen in einem Brutschrank (37 ° C) über Nacht. Am nächsten Tag, mit sterilem dH 2 O 3x und ermöglichen Deck vollständig trocken. </li><li> Machen Sie 75 ul Aliquots von 1 M Milchsäure und 200 ul Aliquots von Glutamax, bei -20 ° C Vollständig aufzutauen Aliquots von Milchsäure und Glutamax vor der Verwendung bis zur Homogenität zu gewährleisten. </li><li> Am Tag der Ernte Neuronen, machen 30 ml frischem Kulturmedium, bestehend aus Hibernate-A Lager 1 mM Milchsäure, 0,5 mM Glutamax und 2% B27 ohne Insulin. VoRTEX und pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. </li><li> Setzen Sie 10 ml Kulturmedium in einer 60 mm Glaspetrischale auf Eis gelegt 2 ml in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis und die restlichen Medien halten bei Raumtemperatur. </li><li> Am Tag der Ernte Neuronen, machen 25 ml frisches Wachstumsmedium, bestehend aus Neurobasal Lager, die 1 mM Milchsäure, 0,5 mM Glutamax und 2% B27 ohne Insulin. Wirbel-und pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. Den frischem Wachstumsmedium in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für mindestens 30 min äquilibrieren. </li></ol> 3. Herz Perfusion <ol><li> Vollständig aufzutauen 200 ml Perfusionslösung und Oxygenat mit 95% O 2/5% CO 2 auf Eis für mindestens 15 min. </li><li> Waschen ein Vibratom Klinge mit Aceton, 70% Ethanol und dH 2 O. Positionieren Sie die Klinge in der Vibratom. </li><li> Die Vibratom Kühlkammer und Infusionsschlauch mit dH 2 O spülen Füllen Sie den Kühlraum (4 ° C) Mit Perfusionslösung und weiterhin Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Betäuben eine Maus mit Pentobarbital-Natrium 50 mg / ml, verdünnt 1:1 mit sterilem Wasser, intraperitoneal injiziert. Überprüfen Sie, ob die Maus vollständig durch Einklemmen des Schwanzes und die Beobachtung keine Antwort betäubt. </li><li> Gießen Sie kaltes Perfusionslösung in die Perfusion Reservoir-und Schlauch kurz vor Dissektion. Sparen Sie 20 bis 30 ml für Gehirn Dissektion und weiterhin auf Eis Sauerstoff zu versorgen. Schwerkraft von einem erhöhten 60-ml-Spritze durch den Schlauch und eine 20 G-Nadel bietet ausreichende Strömung. Anschließend Lösung laufen, bis keine Luftblasen heraus gewaschen. Fahren Sie mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Schnitt zurück Haut über dem Brustkorb der Maus. Heben Sie den Brustkorb und sorgfältig machen einen horizontalen Schnitt durch die Membran. Machen Sie zwei seitliche Schnitte durch den Brustkorb bis zu den Armen, um das Herz freizulegen. Verwenden einer Pinzette, um den Brustkorb zurückzuhalten. </li><li> Machen Sie eine kleine 2 mm Schnitt in den rechten Vorhof, eine Austrittspunkt für Blut aus der Vascu gewaschen werden kannSolaranlage. </li><li> Die Punktion des linken Ventrikels mit der Perfusion Nadel, gerade genug, um die Nadelöffnung einfügen. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle mit einer Hand und beginnen den Fluss der Perfusionslösung mit der anderen Hand. Nach 10-15 ml Perfusionslösung, sollte das Blut ausgewaschen und das Abwasser wird klar sein. </li></ol> 4. Gehirn-Slicing und Dissection <ol><li> Nach der Herzdurchblutung, die Übertragung mit Sauerstoff angereichert kalten Perfusion Lösung in eine Petrischale auf Eis kurz vor der Verwendung. </li><li> Schnell enthaupten, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen das Gehirn in Perfusionslösung. Um das Gehirn zu entfernen: Ziehen Sie die Haut vor, einen Schnitt in der Mittellinie in Richtung Schädel der Augenhöhlen, machen zwei seitliche Schnitte zu jedem Auge, verwenden Sie Pinzette, um jede Seite des Schädels zurück zu ziehen, machen Sie einen koronalen Schnitt zwischen den Augenhöhlen, und verwenden Sie einen Spachtel, um sanft zu locken hinaus in das Gehirn Perfusionslösung. Mit einer Schere bei Bedarf die optischen Bahnen geschnitten. Tun Sie das nicht zu berühren Hypothalamic Bereich und nicht die optischen Bahnen ziehen, da dies macht zu viel Druck auf der Eminentia mediana und der zugrunde liegenden Hypothalamus Gewebe. </li><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge und Nadel seitlich schneiden das Hirngewebe ca. 3 mm hinteren und vorderen an den Hypothalamus, während das Gewebe eingetaucht ist (Bregma -3,52 mm). Es ist besonders wichtig für die vorderen Seiten Schnitt auf Ebene sein, so dass das Gehirn gerade auf dem Vibratom Futter zu sitzen. </li><li> Entfernen Sie die restlichen Hirngewebe aus der Lösung und verwenden Filterpapier aus dem Gehirn montiert Abschnitt Docht entfernt Lösung. </li><li> Setzen Sie einen Klecks Sekundenkleber auf einem Vibratom Spannfutter und verteilt den Kleber auf die Größe des Gehirns. Setzen das Hirngewebe über der Klebe mit der vorderen Seite nach unten und der Hypothalamus vor der Klinge. Wick entfernt überschüssigen Kleber und legen Sie das Futter in die Vibratom Kühlkammer. Seien Sie vorsichtig, nicht zu viel Kleber zu verlassen, wie es sprudeln rund um das Gehirn, wenn sie in Lösung gebracht. </li><li> Mit der Vibratome zu einer langsamen Geschwindigkeit (Stufe 2) und hoher Amplitude (Stufe 9) eingestellt ist, machen 300-500 um Scheiben bis zum Erreichen der Hypothalamus-Bereich. Jetzt machen dünne Scheiben schneiden 100 um vom hinteren zum vorderen. Die visuelle Signale sind wie folgt. Hinter dem Hypothalamus der dritte Ventrikel wird sehr klein sein (Bregma -2,70 bis -2,30 mm). Bei Bregma -2.30 mm, wird der dritte Ventrikel in Rücken-und Bauchschnitte am koronalen Scheibe getrennt. </li><li> Sobald Abschnitte des dritten Ventrikels Sicherung, machen zwei Scheiben, die 500 um die richtige Region des VMH (Bregma -2,18 bis -1,22 mm) enthalten wird. Anterior des VMH, das dritte Ventrikel nicht mehr reicht bis zur ventralen Boden des Gehirns (Bregma -1.06 bis -0.82) 8. </li><li> Übertragen Sie diese Scheiben auf die Petrischale auf Eis haltigen Kulturmedien. Sezieren die VMH (VMN + ARC), wie in Fig. 1 gezeigt. Mit einer Pipette vorsichtig übertragen Sie die VMH Stücke in 2 ml Kulturmedium auf Eis. </li></ol> 5. Dissoziation und Kultur <ol><li> Entfernen Sie die VMH aus Eis und legen bei Raumtemperatur. Mit 20 U / ml Papain zu 4 ml Kulturmedium. Kehren Sie in einem 34 ° C Wasserbad mischen und Ort. Prüfen und mischen durch Umdrehen jede Minute, bis die Verdauung Medien ist nicht mehr trüb. Filter (0,22 um) in eine sterile Flasche und das Gewebe zu übertragen, um die Verdauung Medien. </li><li> Verdauen das Gewebe durch Schütteln mit 100 Upm bei 34 ° C für 30 min. </li><li> Herstellung von 1 ml Medium mit 8% Rinderserumalbumin (BSA) bei der Verdauung. Man löst 80 mg BSA in 1 ml Kulturmedien und Filter (0,22 &amp;mgr; m) in einem konischen Röhrchen. </li><li> Durch Übertragung von 5 ml Kulturmedium in einem konischen Röhrchen und langsam umdrehen, wenn das Gewebe zu waschen. </li><li> In 30 ul Enzym DNase bis 6 ml Kulturmedien und mischen, um Verreiben Medien zu machen. Saugen Sie die Waschmedien und 3 ml Verreiben Medien. </li><li> Verwenden Sie die Glaspipetten in der Größenordnung von l verreibenargest zum kleinsten. Sanft verreiben und dann warten, 10x 4 min für größere Stücke zu begleichen. Verwenden Sie die zweite Pipette, um die Top 2 ml, die eine dissoziierte Zellsuspension auf eine neue konische Röhrchen übertragen. 2 ml Verreiben Medien, verreiben 10x und 3 min warten. Verwenden Sie die dritte Pipette, um die Top 2 ml der Zellsuspension übertragen. 1 ml der Verreiben Medien, verreiben und warten 5x 2 min. Verwenden Sie die Pipette, um die vierte Top 2 ml der Zellsuspension übertragen. </li><li> Schicht die dissoziierten Zellsuspension auf der 8% BSA, man aufpassen, nicht zu verwechseln. Zentrifugieren bei 1000 rpm für 5 min. </li><li> Platzieren autoklaviert 6 mm x 8 mm Klonen Zylinder in der Mitte jedes Deckglas. Die Deckgläser müssen vollständig trocken sein. Verwerfen und das Pellet in 440 ul warmen Wachstumsmedien. Füllen Sie das Klonen Zylinder mit der neuronalen Suspension und in den Brutschrank für 20 min. </li><li> Entfernen Sie die Klonierung Zylinder und sehr vorsichtig waschen weg Schmutz. Füllen Sie jedes Gericht with 2 ml Wachstumsmedium. Sodass die Zellen mindestens 1 Stunde zu erholen, bevor irgendwelche Tests werden durchgeführt. </li></ol> 6. Vorbereitung für MPD Imaging <ol><li> Machen Aufzeichnungslösung, bestehend aus 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 0,1 mM MgCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 0,97 mM K 2 HPO 4, 0,23 mM KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3 und 25 mM HEPES. Den pH-Wert auf 7,4. </li><li> In Glucose, um die gewünschte niedrige Glukose-Testlösung (0,1-2,0 mM Glukose) zu machen. Gründlich mischen und behalten 400 ml niedrige Glukose-Recording-Lösung. In Glukose zu den restlichen 600 ml bis 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung machen und gründlich mischen. </li><li> Schützen Farbstoff aus Licht so viel wie möglich. 4 ml Puffer Raumtemperatur auf eine Blue MPD Fläschchen. Gründlich mischen und mit 5 ul Farbstoff pro ml Aufzeichnungslösung. Halten homogene Lösung durch Mischen mit Pipette zwischen den Lösungen. Der Farbstoff enthält fluoreszierende molecules, die Zellen mit Depolarisation eingeben und Quencher-Moleküle, welche die Zellmembran nicht durchqueren können. Aliquote können bei -20 ° C gelagert und innerhalb von 4 Tagen verwendet werden. Frost-Tau nicht mehr als einmal. </li><li> Inkubieren Zellen in 2 ml 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung plus Farbstoff bei 34 ° C für 30 min. Ein trockener Heizungsblock verwendet werden kann. Vor Licht schützen. </li><li> Bereiten Spritzenpumpen und Durchblutungssystem mit 2,5 mM und 0,1 mM Aufzeichnungslösungen sowie Farbstoff. Schlauch von 60 ml Spritzen sollte mit einem Verteiler verbunden sein. </li><li> Nach Beendigung einer Pumpe, warten ~ 10 Sekunden vor Switching-Lösungen auf dem Verteiler zu Druckaufbau in der Spritze zu verhindern. Druckänderungen verändern Flüssigkeitszufuhr zu der geschlossenen Kammer, die die Neuronen, was zu Veränderungen in der Fokusmikroskop während des Experiments und Verzerrung der Bilder. </li><li> Der Verteiler Ausgangsleitungen sollten auf eine In-line-Heizelement und Polyethylenschlauch, der in eine geschlossene Kammer verbindet, verbunden sein.<html> Bubbles sollte gelöscht werden und die Durchblutung Rate sollte auf 0,5 ml / min eingestellt werden. Vor Licht schützen. </li><li> Übertragen Sie 25 mm Deckglas mit anhaftender Neuronen in die geschlossene Kammer, man aufpassen, nicht zu erlauben, Deckglas zu trocknen und keine Luftblasen einzuführen. Der Schlupf wird in den Rillen der Bodenstück ausgerichtet ist, ein paar Tropfen des Aufzeichnungslösung an den Seiten platziert, und das Oberteil wird sanft ausgestattet, um das Deckglas in Position zu halten. </li><li> Verwenden Sie eine Pipette, um die Kammer mit Aufzeichnungslösung zu füllen und dann ein 18 mm Deckglas auf. Passen Sie vorsichtig weißen Ring in die Kammer, um den kleineren Deckglas in Position zu halten. Drücken sehr langsam und leicht zu Luftblasen in die geschlossene Kammer eingeleitet wird. </li><li> Starten Sie die Spritzenpumpe für die 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung, drücken Sie auf den weißen Ring, und eine Verbindung zu der geschlossenen Kammer. Langsam loslassen Druck von weißen Ring und eine Verbindung zum Schlauch führt zu einem Abfallbehälter. </li></ol>e &quot;&gt; 7. MPD Imaging <ol><li> Zentrieren Sie die Neuronen mit niedrigen Hellfeld-Licht. Versuchen Sie, die Zeit, die Zellen, die dem Licht ausgesetzt zu minimieren. </li><li> Damit das Perfusionssystem für 10 min durchgeführt, um zur Stabilisierung der Temperatur, Scharfstellung und Farbstoff Gleichgewicht. </li><li> Während Grundierung, öffnen Sie das Programm MetaMorph und nehmen eine Hellfeld-Bild (10X) der Neuronen. Verwenden Sie die Auto-Fokus-Funktion zu 3 Stapel von Fluoreszenzbildern (150 ms, Enge Cy3-Filter, 10X) zu nehmen und festzustellen, den Fokus innerhalb 5 um. Am Ende der 10 Minuten Vorbereitungszeit, überprüfen Sie den Fokus noch einmal. </li><li> Fangen Sie an, Fluoreszenzbilder für 40 Minuten alle 30 Sekunden aufzeichnen. Stellen Sie die Basislinie bei 2,5 mM Glukose für 10 min, dann verringern Glukose für 15 min und schließlich auf 2,5 mM Glucose für 15 min zurück. Lösungen werden durch Stoppen einer Spritzenpumpe, wartet 10 Sekunden, Drehen eines Anschlusses auf dem Verteiler, und man eine andere Spritzenpumpe verändert. Änderungen sollten vor der gewünschten Zeitpunkten auftreten baSed von der Verzögerung zwischen dem Verteiler und Zellen. </li><li> Nach der Aufnahme aller Fluoreszenzbilder, nehmen Sie einen hellen Feldbild der Neuronen. </li></ol> 8. MPD Imaging Analysis <ol><li> Verwenden MetaMorph bis ovale Regionen um jede Zelle in der Hellfeld-Bild am Ende des Experiments genommen erstellen. Die Regionen sollten etwas größer als jedes Neuron sein und kann aus 1 Pixel außerhalb des dunklen Rand der Zelle werden. Wählen Sie keine Zellen, die ungesund, überlappend oder in der Nähe Trümmer sind. Ungesunde Zellen erscheinen oft dunkel. Schließlich erstellen 5 großen, ovalen Regionen in Bereichen ohne Zellen oder Fremdkörper für die Hintergrundmessungen. </li><li> Übertragen Sie die Regionen für alle Fluoreszenzbilder und überprüfen, um zu überprüfen, dass keine Bewegung / Verschiebung stattgefunden hat. Verwenden Sie die Funktion Messen, um die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Region für alle Bilder in einer Excel-Datei aufzeichnen. Die Verwendung von Zeitschriften in Metamorph wird empfohlen. </li><li> Erstellen Sie in Excel einen Durchschnitt der 5 Hintergrundbereiche für jede fluoreszierent Bild. Dies stellt den mittleren Hintergrundwert zu jedem Zeitpunkt. Für jedes Bild / Zeitpunkt, subtrahieren Sie den Hintergrund aus allen Region Messungen. Der Hintergrund-Fluoreszenzintensität subtrahiert wird als Intensität im Folgenden bezeichnet werden. </li><li> Für jede Zelle, die Berechnung der durchschnittlichen Intensität während 2-8 Minuten der Aufnahme. Dies entspricht der Grundlinie der Zelle in 2,5 mM Glucose. A 2 Minuten Puffer an beiden Enden jeder Behandlung wird verwendet, um das Rauschen zu minimieren. </li><li> Für jede Zelle, die Berechnung der prozentualen Veränderung vom Ausgangswert (Baseline-Intensity) / Baseline </li><li> Erstellen Sie ein Liniendiagramm mit der prozentualen Veränderung vom Ausgangswert gegenüber der Zeit. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangswert bei 18 bis 23 Minuten. Berechnen Sie die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangswert bei 35 bis 40 Minuten. Während der Bildverarbeitung verwendet wird, wird das Rauschen durch die Mittelung der Intensität innerhalb jeder Zellenbereich, Hintergrund-Subtraktion, und der Mittelung der Intensitätsbereich über 5 min o reduziertr mehr. </li><li> Kontrollexperimente, in dem 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung mit 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung ausgetauscht durchzuführen, um den Rauschen-Schwellenwert zu bestimmen. Berechnen Sie die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangswert bei 18 bis 23 Minuten für mindestens 6 Gerichte und drei Mäusen. Bestimmen Sie den Mittelwert und Standardabweichung dieser Werte. </li><li> Die Schwelle für eine positive Antwort auf die Depolarisation Mittelwert plus 2 Standardabweichungen. Der Mittelwert plus 2 Standardabweichungen entspricht einer Differenz bei p &lt;0,05. Unsere Kontrollversuche ergaben eine 10% Veränderung zum Ausgangswert als den geeigneten Schwellenwert. </li><li> Für jede Zelle, beurteilen die reversible Reaktion Depolarisation basierend auf 2 Kriterien. Erstens muss die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangs während 18-23 Minuten mehr als 10%, das in dem vorhergehenden Schritt bestimmten Schwelle liegen. Zweitens muss die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangs während 35-40 Minuten weniger als die Hälfte der durchschnittlichen prozentualen Änderung von seinBaseline während 18-23 Minuten. Das zweite Kriterium wurde gewählt, weil es wurde festgestellt zu sein, die strenger sind als die Stimulation mit Glutamat oder KCl. Ungesunde Neuronen oft auf die Stimulation mit Glutamat oder KCl reagieren, obwohl ihre Antworten zu einer verminderten Glukose sind nicht reversibel. </li><li> Für jedes Gericht, berechnen Sie die Verzehr% der Neuronen. Dieser Wert wird verwendet, um die GI% der Neuronen unter verschiedenen Behandlungsgruppen quantifizieren. </li></ol>

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	<li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+neurons:+are+they+physiologically+relevant?.">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?.</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li><li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li><li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+insulin,+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li><li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons.">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li><li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose.">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing.">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons.">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).</li><li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li><li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Der Schlüssel zu der Möglichkeit, Aktivität von Nervenzellen aus adulten Mäusen untersucht werden, ist die Fähigkeit, gesunde Neuronen zu distanzieren. Die Dissoziation von Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen ist an mehreren wichtigen Schritte im Protokoll schwieriger im Vergleich zu Neuronen aus jungen Mäusen. Wir haben dieses Problem auf mehrere Arten zu überwinden. Machen 500 um dicken Hirnschnitten minimiert mechanische Schädigung von Neuronen im Vergleich zu den üblichen 250-350 um Scheiben für ...

Das Gehirn reguliert Energie-Homöostase durch die neuroendokrinen und autonomen Nervensystem. Ventromedialen Hypothalamus (VMH), des ventromedialen Nukleus (VMN) und dem bogenförmigen Kern (ARC) umfassen, ist für die zentrale Überwachung der Energie Homöostase. Specialized Glukosemess Neuronen im VMH, link neuronale Aktivität und peripheren Glukose-Homöostase ein. Es gibt zwei Arten von Glucose Sensor-Neuronen, Glucose angeregt (GE) Neuronen zu erhöhen, während Glukose gehemmt (GI) Neuronen ihre Aktivität verringern, wie extrazelluläre Glukose steigt. VMH Glucose Sensor-Neuronen sind in der Regel mit Hilfe der Elektrophysiologie oder Calcium / Membranpotential empfindlichen Farbstoff-Bildgebung untersucht. Die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik gilt als der Goldstandard in der Studie der ex vivo neuronalen Aktivität sein. Bei dieser Technik wird eine Glas-Mikropipette Elektrode an die Zellmembran über einen hohen Widerstand angeschlossen(GOhm) Siegel. Patch-Clamp-Elektroden ermöglichen Echtzeit-Aufzeichnung von Aktionspotentialfrequenz (Stromzange) oder Ionenleitfähigkeit (Spannungsklemme) innerhalb eines einzelnen Neurons verändert. Während der Patch-Clamp-Technik liefert detaillierte Informationen über Änderungen in bestimmten Ionenkanalleitfähigkeiten, ist ein großer Nachteil, dass nur ein Neuron in einer Zeit beobachtet. Es dauert ca. 30-45 min von Aufnahme zu beginnen, bevor auch nur eine bestimmte experimentelle Behandlung zu überprüfen, ob man die Aufnahme aus einer Glucose-Mess Neurons. Außerdem umfassen GI und GE Neuronen &lt;20% der Gesamt VMH neuronalen Population. Compounding dieses Problem ist der Mangel, in vielen Fällen eine Identifizierung zellulärer Marker für diese Neuronen. So ist es klar, dass trotz wertvolle elektrische Informationen, die andere Techniken nicht, ist Patch-Clamp-Analyse mühsam, zeitaufwendig und geringe Ausbeute. Die Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebungs dissoziierter VMH Neuronen ermöglicht die Untersuchung von hundreds von Neuronen gleichzeitig. Calcium-sensitiven Farbstoffen verwendet werden, um intrazellulären Calcium-Änderungen, die indirekt auf Veränderungen der neuronalen Aktivität korrelieren zu messen. Membranpotential empfindliche Farbstoffe verwendet werden, um Membranpotential Änderungen zu überwachen. Mess zellulären Membranpotentials ist ein direkter Index der neuronalen Aktivität im Vergleich zu Veränderungen der intrazellulären Kalziumspiegel. Außerdem Membranpotential-Farbstoff (MPD)-Bildgebung erfasst potenziell kleinere Änderungen des Membranpotentials, wo Aktionspotential Brenn nicht verändert wird und intrazellulären Kalziumspiegel nicht ändern könnten. Diese beiden Fluoreszenz-Bildgebungstechniken verwendet worden, um VMH Glucose erfassenden Neuronen von jungen Mäusen 2-7 studieren. Während die Ergebnisse sind weniger detailliert als die mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie erhalten, ist die Stärke des bildgebenden Experimenten, dass sie bewerten, gleichzeitig eine große Population von Zellen, die auf jeden Fall auch eine beträchtliche Anzahl von Glukosemess Neuronen. MPD Bild iist besonders nützlich für die Untersuchung GI Neuronen, die gleichmäßiger über den gesamten VMH lokalisiert sind, wodurch eine ausreichende Population in der dissoziierten VMH (~ 15% GI) zu studieren. Im Gegensatz dazu, während GE Neuronen sind dicht an den ventrolateralen VMN-und Zell armen Bereich zwischen der ARC und VMN lokalisiert, sie stellen keine signifikante Anzahl von Neuronen innerhalb des VMH (&lt;1% GE). Darüber hinaus wird durch das Studium isoliert Neuronen, Astrozyten und präsynaptischen Effekte eliminiert werden. Dies kann ein Vorteil bei der Untersuchung ersten Neuron-Effekte, als auch ein Nachteil sein, da physiologischen Verbindungen und Prozesse verloren gehen. Ein limitierender Faktor sowohl Patch-Clamp-Elektrophysiologie und MPD / Calcium-Farbstoff-Bildgebung ist die Notwendigkeit, jüngere Tiere (zB. Mäuse oder Ratten &lt;8 Wochen alt) zu verwenden. Dies ist vor allem aufgrund der erhöhten Bindegewebe in Kombination mit einer verminderten neuronalen Lebensfähigkeit, die mit zunehmendem Alter auftritt. Im Gehirn-Slice-Elektrophysiologie Gestütn stellt erhöhte Bindegewebe es schwieriger, die Neuronen zu visualisieren. Vermehrter Bindegewebs macht es auch schwieriger, eine große Anzahl von gesunden Neuronen für Bildgebungsuntersuchungen dissoziieren. Außerdem Neuronen von jüngeren Tieren länger überleben entweder während der Aufnahme oder Patch-Clamp-Bildgebung. Jedoch kann die Verwendung von jungen Mäusen eine große Einschränkung sein. Neuronale Aktivität und / oder Antworten auf Neurotransmitter oder zirkulierenden Nährstoffen mit dem Alter verändern. Da beispielsweise die Energiebilanz ist eng mit reproduktiven Status gebunden, die Neuronen des Hypothalamus Regelenergiebilanz unterschiedlich in der Vor-vs postpubescent Tiere reagieren. Darüber hinaus haben viele Krankheiten erfordern eine langfristige Behandlung oder nicht erst im Erwachsenenalter manifestieren. Herausragende Beispiele für solche Erkrankungen sind Nahrungs Adipositas oder Typ-2-Diabetes mellitus. Da Glukose-Mess Neuronen werden vermutlich eine Rolle bei diesen Erkrankungen spielen wir eine Methode entwickelt, für die erfolgreiche Kultivierung von gesunden Erwachsenen VMH Neuronen für den Einsatz in Bild MPD experiments.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neurobasal-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050128DJ</td>
			<td style="width:427px;">custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Hibernate-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">BrainBits</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">15140</td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Stericup vacuum filter units (0.22 &#956;m)</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">25 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 25mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">18 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 18mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">B27 minus insulin (50x)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050129SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Razor blade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Vibratome &#38; cooling chamber</td>
			<td style="width:115px;">Vibratome</td>
			<td style="width:180px;">Series 1000 Sectioning system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences</td>
			<td style="width:180px;">22370</td>
			<td>injector or double edge blades from other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Papain, suspension</td>
			<td style="width:115px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS003124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">BSA, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">DNAse, for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">cloning cylinders, 6 mm x 8 mm</td>
			<td style="width:115px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:180px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Membrane Potential Dye (blue)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;">R8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">In-line heater</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:115px;">WPI</td>
			<td style="width:180px;">sp100i</td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Closed chamber</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">RC-43C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">PE-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Metamorph</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>alternate image analysis software acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">BX61 WI</td>
			<td>
			used with 10X&#160;objective
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Camera</td>
			<td style="width:115px;">Photometrics</td>
			<td style="width:180px;">Cool Snap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Narrow Cy3 Filter Set</td>
			<td style="width:115px;">Chroma</td>
			<td style="width:180px;">41007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Illumination System</td>
			<td style="width:115px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:180px;">Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane potential dye imaging of ventromedial hypothalamus neurons from adult mice to study glucose sensing

Studium der neuronalen Aktivität werden oft unter Verwendung von Neuronen aus Nager weniger als 2 Monaten aufgrund der technischen Schwierigkeiten mit zunehmender Bindegewebe verbunden und verringerte neuronale Lebensfähigkeit, die mit dem Alter auftreten. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Dissoziation von gesunden Neuronen des Hypothalamus von Erwachsenen-Alter von Mäusen. Die Fähigkeit, Neuronen aus adulten Mäusen untersucht Alters erlaubt den Einsatz von Krankheitsmodellen, die in einem höheren Alter manifestieren und könnte für bestimmte Studien mehr entwicklungs genau sein. Fluoreszenz-Imaging von dissoziierten Neuronen verwendet werden, um die Aktivität einer Population von Neuronen zu untersuchen, im Gegensatz zur Verwendung der Elektrophysiologie an einem einzigen Neuron zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung eines heterogenen neuronalen Population in dem die gewünschte neuronale Aktivität ist selten wie Glucose Sensor-Neuronen des Hypothalamus. Wir verwendeten Membranpotential Farbstoff Bildgebung des ventromedialen Hypothalamus erwachsenen Neuronen, um ihre Reaktionen zu studieren changes in der extrazellulären Glucose. Glucose Sensing-Neuronen werden geglaubt, um eine Rolle in der zentralen Regulierung der Energiebilanz spielen. Die Fähigkeit, Glukose-Mess bei erwachsenen Nagetieren zu studieren, ist besonders nützlich, da die Dominanz von Krankheiten, die dysfunktionalen Energiebilanz (zB. Adipositas) nehmen mit dem Alter zusammen.

Die genaue Präparation des VMH von anderen Bereichen des Hypothalamus ist wichtig, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Die Einbeziehung von anderen Bereichen könnte die VMH neuronalen Population zu verdünnen, die Änderung der Verzehr% der Neuronen berechnet. Weiterhin wurden Glucose erfassenden Neuronen im Hypothalamus anderen Regionen, wie beispielsweise die lateralen Hypothalamus, die funktionell und mechanistisch von VMH Glucosesensorneuronen abweichen identifiziert. Fig. 1 zeigt die korrekten...

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Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Die Aktivität der einzelnen Neuronen aus erwachsenen Alters Mäusen kann durch distanziert Neuronen aus bestimmten Hirnregionen und unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff Membranpotential Bildgebung untersucht werden. Durch Prüfung Antworten auf Veränderungen in Glucose, kann diese Technik verwendet, um die Glucoseempfindlichkeit von Erwachsenen ventromedialen Hypothalamus-Neuronen zu untersuchen.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Aufrufe.  Rutgers New Jersey Medical School.  Die Aktivität der einzelnen Neuronen aus erwachsenen Alters Mäusen kann durch distanziert Neuronen aus bestimmten Hirnregionen und unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff Membranpotential Bildgebung untersucht werden. Durch Prüfung Antworten auf Veränderungen in Glucose, kann diese Technik verwendet, um die Glucoseempfindlichkeit von Erwachsenen ventromedialen Hypothalamus-Neuronen zu untersuchen. 

Serie: Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.