Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung des National Institute for Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health unterstützt. Wir danken Johannes Huppa und Mark Davis, der uns mit dem scFv von H57 in diesen Studien verwendet. RV möchte Keir Neumann für hilfreiche Diskussionen bedanken bei der Entwicklung dieser Technik.

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	<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor:+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function.">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.T+cell+activation.">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways.">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li><li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+network:+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells.">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li><li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li><li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling.">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li><li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor.">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li><li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling.">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li><li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses.">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li><li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse.">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li><li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse.">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7:+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events.">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li></ol>

Alle Tiere in diesen Experimenten verwendet wurden in einem spezifischen Pathogen-freien Umgebung gehalten, und die Experimente wurden von den National Institutes of Health Animal Care und Use Committee gebilligt.

Wir beschreiben hier ein System zu studieren Signalisierung in Antigen-spezifischen T-Zellen, primäre Maustaste mit TIRFM und Glas unterstützten Lipiddoppelschichten als künstliche APCs. Die Technik beruht auf erfolgreich exprimieren GFP-markierten Proteine ​​in diesen Zellen. Transfektion von T-Zellen ist immer eine anspruchsvolle Aufgabe. Typischerweise werden Elektroporation oder Gentransfer mit Retroviren oder Lentiviren verwendet. Eine Technik ist nicht überlegen über das andere, beide haben ihre Grenzen und Vorteile. Wir finden, dass die Elektroporation hat folgende Vorteile: 1) Es ist nicht erforderlich, dass die Zellen aktiv werden Unterteilen wie Retroviren, aber nicht Lentiviren erforderlich ist, und 2) Die Expression kann durch Variieren der Zeit wurden die Zellen vor der Bebilderung inkubiert werden, gesteuert werden. Der größte Nachteil ist, dass wir es sehr schwierig, Proteine, die große Abmessungen in primären Zellen auszudrücken. Wir haben eine Methode, die uns sehr gut die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Elektroporation vorgestellt. Als ein Ergebnis ist es geltenden Gesundheitsschutzmaßnahmenle zu benutzen, um siRNA-vermittelten Gen-Silencing zu erreichen. Wir beschreiben hier eine maßgeschneiderte Zwei-Kanal gleichzeitige Erfassung TIRF Mikroskop, das chromatisch korrigiert wird, und erfordert keine separate Ausrichtung für verschiedene Wellenlängen. Diese Funktionen, jedoch sind im Handel erhältlich. Unser System basiert auf den Prinzipien der TIRF-Mikroskopie veröffentlicht von Experten auf diesem Gebiet und ist billiger als kommerzielle Alternativen basieren. Eine mögliche Kritik an unserem Design ist, dass wir mit dem gleichen Einfallswinkel für die verschiedenen Anregungswellenlängen. Dies würde in einer anderen TIRF Eindringtiefe für verschiedene Anregungswellenlängen führen. Wir glauben, dass diese Effekte gering sind, da die evaneszente Welle ist eine exponentiell abklingende Feld und die Tiefe der TIRF Feld ist eine lineare Funktion der Wellenlänge. Fluorophore nahe der Glasoberfläche erleben keinen Unterschied in der Intensitäten zwischen den beiden Wellenlängen. Für Fluorophore in der Nähe des PEnetration Tiefe wird die Intensitätsunterscheidung 1,3-fachen für die beiden Wellenlängen 488 und 640 nm und 1,15-fachen für die beiden Wellenlängen 488 und 561 nm sein. Das gleiche System kann in Verbindung mit Super-Resolution-Techniken, die Verwendung von TIRF-Beleuchtung machen eingesetzt werden. Wir haben auch ein zwei Kamera-System, das speziell angefertigten ist beschrieben. Wie die TIRF-System, sind ähnliche Apparate auch kommerziell erhältlich. Unser System bietet Flexibilität, um die Filter und dichroics zu ändern, was ihre Anwendung bei verschiedenen Kombinationen von Wellenlängen. Der Nachteil des eigenen Systems ist der Grad der Drehung um die beiden Bilder auszurichten. Dieses Problem kann durch die Verwendung Kamera steht, die Piezo angetrieben werden und bieten rotatorischen Ausrichtung gelöst werden. Wir haben auch erfolgreich ein Zwei-Kamera-System auf diesem Mikroskop durchgeführt, in dem die Kameras verschieden sind und unterschiedliche Punktgrößen. Ein solches System wäre nützlich, wenn man brauchte Empfindlichkeit in einen Kanal und einen großen dyDynamikbereich in einem anderen, sind die beide nur selten in der gleichen Kamera zur Verfügung. Wir nutzten die Photometrics HQ-2-Kamera bei 2x2 Binning gibt uns eine effektive Pixelgröße von 12,9 um mit dem Photometrics Quant-EM-Kamera, die eine Pixelgröße von 16 mu m aufweist. Ein 180 mm Brennweite Tubuslinse wurde für die Quant-EM eingesetzt und ein 145 mm Brennweite Tubuslinse wurde für die HQ-2-Kamera verwendet. Der HQ-2 wurde unter Verwendung Metamorph-Software und die Quant-EM wurde über Mikro-Manager-Software auf einem separaten Computer in externe Trigger-Modus gesteuert. Der externe Trigger wurde der Quant-EM-Kamera mit einem digitalen Ausgang des DAC Messung Computing Platine, die als zusätzliche Blende in der configure Beleuchtungseinstellungen Metamorph umgesetzt wurde bereitgestellt. Das Verhältnis der Brennweiten der Tubuslinsen entspricht dem Verhältnis der effektiven Pixelgrößen. Eine repräsentative Ausrichtung in 5 gezeigt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit für Maus-T-Zellen </td><td> Lonza Inc. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> Für Endotoxin freie DNA PREPS </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector- </td><td> Lonza Inc. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes Mäuse-IL-2 </td><td> Peprotech Inc. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-Well-Kammer-Deckglas </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

Diese Signalisierung wird durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) ausgelöst wird, wenn es durch antigene Peptidfragmente von Haupthistokompatibilitätskomplex (pMHC) Proteine ​​auf der Oberfläche von Antigen präsentierenden Zellen (APC) gebunden zu eingreift. Der TCR-Komplex der Ligandenbindung TCRαβ Heterodimer besteht, das nicht-kovalent assoziierten mit CD3-Dimere (die εδ und εγ Heterodimere und die ζζ Homodimer) 1. Beim Eingriff des Rezeptors, werden die CD3 ζ-Ketten der Src-Familie-Kinase phosphoryliert, Lck. Dies führt zur Rekrutierung der Syk-Familie-Kinase, ZAP70, der dann phosphoryliert wird und durch Lck aktiviert. Danach phosphoryliert ZAP70 den Adapter Proteine ​​LAT und SLP76, initiiert die Bildung des proximalen Signalkomplex, die eine große Anzahl verschiedener Signalmoleküle 2. Die Bildung dieses Komplexes führt schließlich zu Kalzium-und Ras-abhängige transcription Faktor Aktivierung und die daraus folgende Einleitung einer komplexen Reihe von Genexpression, die Anlass zu T-Zell-Differenzierung 2. TCR-Signale (und die daraus resultierende Zustand der Differenzierung) moduliert werden von vielen anderen Faktoren ab, einschließlich Antigen Potenz und Übersprechen mit co-stimulatory/co-inhibitory, Chemokin-und Zytokin-Rezeptoren 3-4. Die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Organisation des proximalen Signalkomplex unter verschiedenen Bedingungen Stimulation ist somit Schlüssel zum Verständnis der TCR-Signalwegs sowie deren Regulation durch andere Signalwege. Ein sehr nützliches Modell zu untersuchenden System Signalisierung von der TCR an der Plasmamembran in T-Zellen initiiert ist Glas-Lipiddoppelschichten, wie zuvor beschrieben 5-6. Sie können verwendet werden, um antigene pMHC Komplexen, Adhäsion und co-stimulatorische Moleküle an T-Zellen-APC, die als künstliche präsentieren. Durch die Abbildung die T-Zellen der Interaktion mit demLipid-Doppelschicht mit innerer Totalreflexion (TIRFM), können wir die Erregung zu beschränken innerhalb von 100 nm von dem Raum zwischen dem Glas und der Zelloberfläche 7-8. Dies erlaubt uns, in erster Linie die Bild Signalisierung Ereignisse an der Plasmamembran. Wie wir in der Abbildung der Einstellung von Signalproteinen an den TCR-Komplex interessiert sind, beschreiben wir ein Zwei-Kamera-TIRF Abbildungssystem, wobei das TCR, mit fluoreszierenden markierten Fab (Fragment antigen-binding) Fragmente des H57-Antikörper (aufgereinigt aus Hybridom H57-597 , ATCC, ATCC Nummer: kann HB-218), die spezifisch für TCRβ ist, und Signalproteine, markiert mit GFP, gleichzeitig und in Echtzeit abgebildet werden. Diese Strategie ist notwendig aufgrund der hohen Dynamik sowohl der T-Zellen und der Signalwege, die an der TCR auftreten werden. Diese bildgebenden Verfahren hat die Forscher einzelne Bild 9-11 Liganden sowie Rekrutierung von Signalmolekülen an aktivierten Rezeptoren und erlaubtist ein ausgezeichnetes System für Biochemie in-situ 12-16 studieren.

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

a-tirf-microscopy-technique-for-real-time-simultaneous-imaging-tcr

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