이 연구는 알레르기 및 감염성 질병, 건강의 국립 연구소의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 우리는이 연구에서 사용 H57의 scFv으로 우리를 제공하는 요하네스 Huppa과 마크 데이비스에게 감사합니다. RV가이 기술의 개발시 유용한 논의 Keir 노이만 감사드립니다.

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	<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor:+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function.">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.T+cell+activation.">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Bezbradica, J. 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이 실험에 사용된 모든 동물들은 무균 환경에서 유지되었으며, 실험은 보건 동물 관리 및 사용위원회의 국립 연구소에 의해 승인되었다.

우리는 여기서 TIRFM과 인조 APCs과 같은 유리를 지원 지질 bilayers를 사용하여 항원에 특정한 기본 마우스 T 세포에 신호를 공부하는 시스템을 설명합니다. 기술은 성공적으로 이들 세포에 GFP 태그가 단백질을 표현에 의존합니다. T 세포를 Transfecting 것은 언제나 어려운 작업입니다. 일반적으로 retroviruses 또는 lentiviruses을 사용하여 electroporation이나 유전자 전달이 사용됩니다. 한 기술은 다른여 우수하지 않으며 모두 자신의 한계와 장점이 있습니다. 1) 이는 retroviruses 아니지만 lentiviruses 필요로 세포가 활발히 분열하는 것이 필요하지 않습니다, 그리고 2) 표현 수준이 세포 이미징 전에 incubated되는 시간을 변화하여 제어할 수 있습니다 : 우리는 electroporation은 다음과 같은 장점이있다 찾습니다. 가장 큰 단점은 우리가 매우 어려운 일차 세포의 크기가 큰 단백질을 표현하는 것입니다. 우리는 electroporation 이후 우리에게 아주 좋은 세포 생존 능력을 제공 방법을 제시했습니다. 결과적으로 그것은 applicab입니다siRNA의 중재 유전자 입을를 달성하기 위하여 그것을 사용 르. 우리는 또한 여기서 chromatically 수정하고 다른 파장에 대해 별도의 정렬이 필요없는 맞춤형 두 채널 동시 수집 TIRF 현미경을 설명합니다. 이러한 기능은 있지만 상업적으로 사용할 수 있습니다. 저희 시스템은 TIRF 현미경 분야의 전문가에 의해 출판 및 상업 대안보다 저렴의 원리에 근거한다. 우리 디자인의 한 가지 비판은 우리가 다른 여기 파장에 대한 발생률의 동일한 각도를 사용하고있다는 것입니다. 이것은 다른 여기 파장에 대해 다른 TIRF의 침투 깊이가 나타날 수 있습니다. 우리는 지극히 미미한 파도가 기하 급수적으로 부패 분야이며 TIRF 필드의 깊이가 파장의 선형 함수이기 때문에 이러한 효과가 작기 생각합니다. 유리 표면에 가까운 Fluorophores는 두 파장 사이의 레이저 농도에는 차이가 발생할하지 않습니다. PE 근처 fluorophores위한netration 깊이는 강도 차이는 두 파장 488 및 561 nm의를위한 두 파장 488 및 640 nm의 및 1.15 배위한 1.3 배 될 것입니다. 동일한 시스템 TIRF 조명을 사용하게 수퍼 해상도 기술과 함께 사용될 수 있습니다. 우리는 또한 사용자 정의 내장입니다 두 카메라의 시스템을 설명했습니다. TIRF 시스템과 마찬가지로 유사한 apparatuses 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다. Google 시스템은 파장의 서로 다른 조합과의 사용할 수 있도록 필터와 dichroics을 변경하는 유연성을 제공합니다. 시스템의 단점은 두 이미지를 정렬하는데 필요한 회전 한 정도입니다. 이 문제는 압전 구동과 정렬의 회전 정도를 제공하고 있습니다 카메라 스탠드를 사용하여 해결할 수 있습니다. 우리는 또한 성공적으로 카메라는 다른 서로 다른 픽셀 크기를 가지고있는이 현미경에 두 개의 카메라 시스템을 구축했습니다. 하나 하나의 채널에서 민감도와 대형 다이 필요한 경우이 같은 시스템이 있으면 좋을 텐데또 다른 namic 범위는, 둘 다 같은 카메라에 거의 사용할 수 없습니다. 우리는 16 μm의의 픽셀 크기를 가지고 Photometrics 양의-EM 카메라와 12.9 μm의의 효과적인 픽셀 크기를 제공 2x2 binning에 Photometrics HQ-2 카메라를 사용했습니다. 180mm 초점 거리 튜브 렌즈는 양의-EM에 사용되었으며, 145mm 초점 거리 튜브 렌즈는 HQ-2 카메라 사용되었다. HQ-2 Metamorph 소프트웨어와 양의-EM은 외부 트리거 모드에서 별​​도의 컴퓨터에 마이크로 매니저 소프트웨어를 통해 제어습니다을 사용하여 통제되었다. 외부 트리거는 Metamorph의 구성 조명 설정에서 추가로 셔터로 구현된 측정 컴퓨팅 DAC 보드의 디지털 출력을 사용하여 양의-EM 카메라에 제공되었다. 튜브 렌즈의 초점 길이의 비율은 유효 픽셀 크기의 비율과 일치합니다. 대표 정렬은 그림 5에 표시됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 마우스 T 세포에 대한 Amaxa Nucleofector 키트 </td><td> Lonza 주식 회사 </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure 플라스미드 Midiprep 키트 </td><td> 생명 기술 </td><td> K2100-05 </td><td> 내독소 무료 디엔에이 preps위한 </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 장치 </td><td> Lonza 주식 회사 </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 Murine IL-2 </td><td> Peprotech 주식 회사 </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> 실험실 - 테크 II 8-잘 chambered coverglass </td><td> 써모 과학, Nunc </td><td> 155,409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

그것이 주요 Histocompatibility 컴플렉스 (pMHC) 항원 제시 세포 (APCs)의 표면에 표현 단백질에 의해 구속 antigenic의 펩타이드 조각으로 종사하는 경우 신호는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 시작됩니다. TCR 복합은 리간드 바인딩 TCRαβ의 heterodimer로 구성되어 있으며 그 동료 인 경우에는 3 번 CD dimers (εδ 및 εγ heterodimers 및 ζζ homodimer) 1 비 covalently. 수용체의 교전시 인 경우에는 3 번 CD의 ζ 체인은 Lck, SRC 가족 키나제에 의해 phosphorylated된다. 이것은 그때 Lck 의해 phosphorylated 및 활성화 Syk 가족 키나제, Zap70의 채용으로 연결됩니다. 그 후, Zap70 다른 신호 분자 2의 다수를 포함하는 근위 신호 단지의 형성을 시작, 어댑터 단백질 LAT와 SLP76을 phosphorylates. 칼슘과 RAS 종속 tra이 복잡한 결국 결과의 형성nscription 요소 활성화 및 T 세포 분화 2 야기할 유전자 발현 프로그램의 복잡한 일련의 논리상 필연의 개시. TCR 신호 (및 분화의 결과 상태)는 항원 힘 및 누화 co-stimulatory/co-inhibitory와 케모카인 및 3-4 시토킨 수용체를 포함한 기타 여러 요인에 의해 변조된 있습니다. 다양한 자극 조건에서 근위 신호 복합 공간과 시간적 조직을 공부한다는 것은 따라서, TCR 신호 경로뿐만 아니라 다른 신호 전달 경로에 의해 그 규정을 이해하는 열쇠입니다. T 세포의 플라즈마 막에서 TCR에 의해 시작 신호를 공부하는 한 매우 유용한 모델 시스템은 이전에 설명한 5-6 유리 지원 지질 bilayers입니다. 그들은 인공 APCs으로 T 세포 자찬에 antigenic의 pMHC 단지, 접착 및 공동 stimulatory 분자를 제시 활용할 수 있습니다. 영상으로 T 세포와 상호 작용총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)를 사용하여 지질 이중층, 우리는 7-8 유리와 세포 표면 사이의 공간을 100 nm의 범위까지 여기를 제한할 수 있습니다. 이것은 우리가 이미지에 주로 신호​​ 이벤트 플라즈마 막에서 발생하실 수 있습니다. 우리 이미징에서 TCR은 복합 단백질 신호의 채용에 관심이있다, 우리는 두 카메라 TIRF 이미징 시스템을 설명하는 어떤 점에서 H57 항체의 형광 팹으로 표시 TCR은 (단편 항원 결합) 조각 (하이 브리 도마 H57-597에서 정화 , ATCC, ATCC 번호 : GFP 태그가 TCRβ에 대한 구체적인 HB-218), 그리고 신호 전달 단백질은, 동시에 실시간으로 몇 군데있을 수 있습니다. 이 전략은 T 세포 모두와 TCR에서 발생하는 신호 이벤트의 높은 동적 특성으로 인해 필요합니다. 이 영상 양상 이미지 단일 리간드 9-11뿐만 아니라 활성화된 수용체에 분자를 신호 모집과 연구자를 허용하고있다12-16 원위치에서 생화학을 공부하는 훌륭한 시스템입니다.

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

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Immunology and Infection

23.7K 조회수.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. 따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.