Cette recherche a été financée par la Division de la recherche intra-muros de l&#39;Institut national pour l&#39;allergie et des maladies infectieuses, les National Institutes of Health. Nous sommes reconnaissants à Johannes Huppa et Mark Davis pour nous fournir le scFv de H57 utilisé dans ces études. RV tiens à remercier M. Keir Neumann de discussion utile au cours du développement de cette technique.

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Tous les animaux utilisés dans ces expériences ont été maintenues dans un agent pathogène spécifique sans l&#39;environnement, et les expériences ont été approuvés par le National Institutes of soins de la santé animale et le Comité utilisation.

Nous décrivons ici un système à étudier de signalisation spécifiques de l&#39;antigène dans les cellules primaires de souris en utilisant T TIRFM et bicouches lipidiques supportées en verre comme les APC artificielles. La technique repose sur l&#39;expression de protéines GFP succès marqués dans ces cellules. La transfection de cellules T est toujours une tâche difficile. En règle générale, la livraison ou l&#39;électroporation des gènes en utilisant des rétrovirus ou lentivirus sont utilisés. Une technique n&#39;est pas supérieure sur l&#39;autre, les deux ont leurs limites et leurs avantages. Nous constatons que l&#39;électroporation a les avantages suivants: 1) Il n&#39;est pas nécessaire que les cellules soient en division active, comme l&#39;exige pour les rétrovirus, mais pas les lentivirus, et 2) Le niveau d&#39;expression peut être contrôlée en faisant varier le temps les cellules sont incubées avant l&#39;imagerie. Le plus grand inconvénient est que l&#39;on trouve qu&#39;il est très difficile d&#39;exprimer des protéines qui sont de grande taille dans les cellules primaires. Nous avons présenté une méthode qui nous donne la viabilité des cellules très bonne après l&#39;électroporation. En conséquence, il est applicable à l&#39;utiliser pour atteindre gene silencing siRNA médiation. Nous décrivons également ici une mesure à deux canaux microscope TIRF simultanée d&#39;acquisition qui est chromatiquement corrigé et ne nécessite pas d&#39;alignement séparé pour différentes longueurs d&#39;onde. Ces capacités, mais sont disponibles dans le commerce. Notre système est basé sur les principes de microscopie TIRF publiées par des experts dans le domaine et est moins cher que les alternatives commerciales. Une critique possible de notre conception est que nous utilisons le même angle d&#39;incidence pour les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation différentes. Cela se traduirait par une profondeur de pénétration différente pour la FRBR longueurs d&#39;onde d&#39;excitation différentes. Nous pensons que ces effets sont faibles, car l&#39;onde évanescente est un champ décroissance exponentielle et la profondeur du champ FRBR est une fonction linéaire de longueur d&#39;onde. Fluorophores proches de la surface de verre connaîtra aucune différence d&#39;intensité laser entre les deux longueurs d&#39;onde. Pour fluorophores près de la peprofondeur netration, la différence d&#39;intensité sera de 1,3 fois pour les deux longueurs d&#39;onde 488 nm et 640 et 1,15 fois pour les deux longueurs d&#39;onde 488 et 561 nm. Le même système peut être utilisé en conjonction avec des techniques de résolution de super qui font usage de l&#39;éclairage TIRF. Nous avons également décrit un système à deux caméra qui est intégrée personnalisée. Comme le système TIRF, appareils similaires sont également disponibles dans le commerce. Notre système offre une flexibilité de changer les filtres et dichroïques, permettant son utilisation avec différentes combinaisons de longueurs d&#39;onde. L&#39;inconvénient de notre système est le premier degré de rotation nécessaire pour aligner les deux images. Ce problème peut être résolu en utilisant la caméra peuplements qui sont parcourus et piézo offrent des degrés de rotation de l&#39;alignement. On a également mis en oeuvre avec succès un système à deux caméras sur ce microscope, dans lequel les caméras sont différents et ont des tailles de pixel différentes. Un tel système serait utile si on avait besoin de sensibilité dans un canal et une grande dyplage dynamique dans une autre, qui tous deux sont rarement disponibles dans le même appareil. Nous avons utilisé le Photometrics HQ-2 à huis clos à binning 2x2 qui nous donne une taille de pixels effectifs de 12,9 um avec l&#39;Photometrics Quant-EM caméra qui a une taille de pixel de 16 microns. A 180 mm de longueur focale de l&#39;objectif du tube a été utilisé pour la Quant-EM et un 145 mm de longueur focale de l&#39;objectif du tube a été utilisé pour l&#39;appareil photo HQ-2. Le HQ-2 a été contrôlé à l&#39;aide de logiciels et de la Metamorph Quant-EM a été contrôlé par micro-gestionnaire de logiciels sur un ordinateur séparé en mode de déclenchement externe. Le déclenchement externe a été fournie à la caméra Quant-EM en utilisant une sortie numérique de la carte DAC de mesure informatique, qui a été mis en œuvre un volet supplémentaire dans les réglages de l&#39;éclairage configure de Metamorph. Le rapport des longueurs focales des lentilles de tube correspond au rapport entre les tailles de pixel efficace. Un alignement représentant est montré dans la figure 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit pour les cellules T de souris </td><td> Lonza Inc </td><td> APV-1006 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink HiPure plasmide Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> Pour preps d&#39;ADN d&#39;endotoxines libres </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector périphérique </td><td> Lonza Inc </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant murin d&#39;IL-2 </td><td> Peprotech Inc </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent microsphères 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-bien chambré lamelle </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

Signalisation est initiée à travers le récepteur de cellule T (TCR) lorsqu&#39;il est engagé par des fragments peptidiques antigéniques liés par Complexe Majeur d&#39;Histocompatibilité (pMHC) des protéines exprimées à la surface des cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC). Le complexe TCR est composé de l&#39;hétérodimère de liaison du ligand TCRαβ qui associe de manière non covalente avec les dimères (CD3 εδ et εγ hétérodimères et l&#39;homodimère ζζ) 1. Lors de l&#39;engagement du récepteur, les chaînes CD3 Ç sont phosphorylées par la kinase de la famille Src, Lck. Cela conduit au recrutement de la famille Syk kinase, ZAP70, qui est ensuite phosphorylée et activée par Lck. Après cela, ZAP70 phosphoryle l&#39;adaptateur protéines LAT et SLP76, l&#39;ouverture de la formation du complexe de signalisation proximale contenant un grand nombre de molécules de signalisation différents 2. La formation de ce complexe entraîne par la suite en calcium et en Ras-dépendante traactivation du facteur nscription et l&#39;initiation par conséquent d&#39;une série complexe de programmes d&#39;expression génique qui donnent lieu à la différenciation des cellules T 2. Les signaux du TCR (et l&#39;état résultant de la différenciation) sont modulés par de nombreux autres facteurs, y compris la puissance d&#39;antigène et la diaphonie avec co-stimulatory/co-inhibitory, chimiokine, et les récepteurs de cytokines 3-4. L&#39;étude de l&#39;organisation spatiale et temporelle du complexe de signalisation dans des conditions de stimulation proximale divers est, par conséquent, essentiel pour comprendre la voie de signalisation du TCR, ainsi que sa régulation par d&#39;autres voies de signalisation. Un système modèle très utile pour étudier de signalisation initiée par le TCR à la membrane plasmique dans les cellules T est bicouches lipidiques de verre soutenus par, comme décrit précédemment 5-6. Ils peuvent être utilisés pour présenter des complexes antigéniques PMHC, l&#39;adhésion et de co-stimulation des molécules pour les cellules T-servant APC artificielles. Par imagerie des cellules T en interaction avec labicouche lipidique en utilisant la microscopie totale interne fluorescence à réflexion (TIRFM), nous pouvons restreindre l&#39;excitation à 100 nm au sein de l&#39;espace entre le verre et la surface de la cellule 7-8. Cela nous permet de l&#39;image surtout les événements de signalisation se produisant à la membrane plasmique. Comme nous nous intéressons à l&#39;imagerie du recrutement de protéines de signalisation au complexe TCR, nous décrivons une à deux caméras d&#39;imagerie TIRF système dans lequel le TCR, marqué par Fab fluorescente (fragment de liaison antigène) des fragments de l&#39;anticorps H57 (purifiée à partir d&#39;hybridomes H57-597 , ATCC, numéro ATCC: HB-218) qui est spécifique pour TCRβ, et les protéines de signalisation, marqué avec la GFP, peut être imagée et simultanément en temps réel. Cette stratégie est nécessaire en raison de la nature hautement dynamique à la fois des cellules T et des événements de signalisation qui se produisent à la TCR. Cette modalité d&#39;imagerie a permis aux chercheurs de ligands seule image 9-11 ainsi que le recrutement de molécules de signalisation des récepteurs activés etest un excellent système pour étudier la biochimie in situ 12-16.

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Le cloisonnement des protéines soit au sein de la membrane plasmique ou dans des endroits intracellulaires est un mécanisme de régulation qui peuvent grandement influencer les résultats de signalisation, d&#39;où, à comprendre la signalisation, il est important d&#39;étudier le comportement spatial et temporel des protéines impliquées. Nous décrivons ici un système de microscopie TIRF base pour étudier la transduction du signal dans les cellules T, mais est largement applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

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23.7K vues.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. Le cloisonnement des protéines soit au sein de la membrane plasmique ou dans des endroits intracellulaires est un mécanisme de régulation qui peuvent grandement influencer les résultats de signalisation, d'où, à comprendre la signalisation, il est important d'étudier le comportement spatial et temporel des protéines impliquées. Nous décrivons ici un système de microscopie TIRF base pour étudier la transduction du signal dans les cellules T, mais est la...