Questa ricerca è stata sostenuta dalla Divisione di Ricerca intramurale dell&#39;Istituto Nazionale per le allergie e malattie infettive, National Institutes of Health. Siamo grati a Johannes Huppa e Mark Davis per averci fornito con il scFv di H57 utilizzato in questi studi. RV ringrazia Keir Neumann di discussione utile durante lo sviluppo di questa tecnica.

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Tutti gli animali utilizzati in questi esperimenti sono state mantenute in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni, e gli esperimenti sono stati approvati dal National Institutes of Health Care degli animali e del Comitato uso.

Descriviamo qui un sistema di segnalazione per studiare in antigene-specifiche cellule T primarie topo usando TIRFM e bistrati lipidici vetro supportate come APC artificiali. La tecnica si basa sul successo esprimenti proteine ​​GFP etichetta in queste cellule. Trasfezione delle cellule T è sempre un compito impegnativo. Tipicamente, consegna elettroporazione o gene usando retrovirus o lentivirus vengono utilizzati. Una tecnica non è superiore rispetto all&#39;altra, entrambi hanno i loro limiti e vantaggi. Troviamo che elettroporazione presenta i seguenti vantaggi: 1) non è necessario che le cellule attivamente divisione come è richiesto per i retrovirus ma non lentivirus, e 2) Il livello di espressione può essere controllato variando il tempo di incubazione le cellule sono prima di imaging. Il più grande svantaggio è che ci trovano molto difficile esprimere proteine ​​che sono di grandi dimensioni in cellule primarie. Abbiamo presentato un metodo che ci dà la vitalità cellulare molto buono dopo l&#39;elettroporazione. Come risultato è applicable di usarlo per raggiungere mediata silenziamento del gene siRNA. Noi descriviamo anche qui una personalizzata due canali simultanei microscopio TIRF acquisizione che è cromaticamente corretto e non richiede l&#39;allineamento separato per diverse lunghezze d&#39;onda. Queste funzionalità, tuttavia, sono disponibili commercialmente. Il nostro sistema si basa su principi di microscopia TIRF pubblicato da esperti del settore ed è più economica rispetto alle alternative commerciali. Una possibile critica del nostro progetto è che stiamo usando lo stesso angolo di incidenza per le diverse lunghezze d&#39;onda di eccitazione. Ciò comporterebbe una diversa profondità di penetrazione TIRF per lunghezze d&#39;onda di eccitazione differenti. Riteniamo che questi effetti sono piccole perché l&#39;onda evanescente è un campo di decadimento esponenziale e la profondità del campo TIRF è una funzione lineare di lunghezza d&#39;onda. Fluorofori vicino alla superficie di vetro non si è avuta differenza di intensità tra i laser due lunghezze d&#39;onda. Per fluorofori vicino al peprofondità netration, la differenza di intensità sarà 1,3 volte per le due lunghezze d&#39;onda 488 e 640 nm e 1,15 volte per il due lunghezze d&#39;onda 488 e 561 nm. Lo stesso sistema può essere utilizzato in combinazione con tecniche di risoluzione super che fanno uso di illuminazione TIRF. Abbiamo anche descritto un sistema a due fotocamera che è costruito su misura. Come il sistema TIRF, apparati simili sono anche commercialmente disponibili. Il nostro sistema offre flessibilità per cambiare i filtri ei dicroici, consentendone l&#39;uso con diverse combinazioni di lunghezze d&#39;onda. L&#39;inconveniente del nostro sistema è un grado di rotazione necessaria per allineare le due immagini. Questo problema può essere risolto utilizzando stand della fotocamera che vengono guidati piezo e offrono gradi di rotazione di allineamento. Abbiamo anche implementato con successo un sistema a due telecamera sul microscopio, in cui le telecamere sono diversi e hanno dimensioni differenti pixel. Un sistema come questo sarebbe utile se quella necessaria sensibilità in un canale ed un grande dygamma dinamica in un altro, entrambi i quali sono raramente disponibili nella camera stessa. Abbiamo usato la HQ-2 Photometrics fotocamera binning 2x2 darci una dimensione in pixel effettivi di 12,9 micron con la Quant-EM camera Photometrics che ha una dimensione del pixel di 16 micron. A mm 180 focale lunghezza del tubo è stato utilizzato per la Quant-EM e 145 millimetri di lunghezza focale lente del tubo è stato utilizzato per la HQ-fotocamera da 2. La HQ-2 è stato controllato tramite Metamorph software e la Quant-EM è stato controllato tramite micro-manager software su un computer separato in modalità trigger esterno. Il trigger esterno è stato fornito al Quant-EM fotocamera utilizzando un uscita digitale della scheda DAC misura di calcolo, che è stato implementato come uno scatto aggiuntivo di configurazione delle impostazioni di illuminazione di Metamorph. Il rapporto tra le lunghezze focali delle lenti tubo corrisponde al rapporto tra le dimensioni effettive pixel. Un allineamento rappresentante è illustrato nella figura 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit per mouse cellule T </td><td> Lonza Inc. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure plasmide Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> Per le preparazioni di DNA endotossine gratis </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector dispositivo </td><td> Lonza Inc. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Ricombinante murino IL-2 </td><td> Peprotech Inc. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microsfere 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-ben chambered coverglass </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

Signaling viene avviata tramite il recettore delle cellule T (TCR), quando è impegnato da frammenti di peptidi antigenici legati da Complesso Maggiore di Istocompatibilità (pMHC) proteine ​​espresse sulla superficie delle cellule presentanti l&#39;antigene (APC). Il complesso TCR è composto dell&#39;eterodimero TCRαβ legame ligando che associa non covalentemente con CD3 dimeri (e le εδ εγ eterodimeri e la ζζ omodimero) 1. Dopo l&#39;impegno del recettore, le catene zeta CD3 sono fosforilate chinasi della famiglia Src, Lck. Questo porta al reclutamento della famiglia Syk chinasi, ZAP70, che viene poi fosforilato e attivato da Lck. Dopo di che, l&#39;adattatore ZAP70 fosforila proteine ​​LAT e SLP76, avviare la formazione del complesso prossimale segnalazione contenente un gran numero di differenti molecole di segnalazione 2. La formazione di questo complesso alla fine i risultati di calcio e di Ras-dipendente TRAnscription attivazione del fattore e la conseguente apertura di una complessa serie di programmi di espressione genica che danno luogo a differenziazione delle cellule T 2. Segnali TCR (e la conseguente stato di differenziazione) sono modulati da molti fattori, compresi potenza antigene e diafonia con co-stimulatory/co-inhibitory, chemochine, recettori di citochine e 3-4. Studiare l&#39;organizzazione spaziale e temporale del complesso di segnalazione prossimale in condizioni di stimolazione è, quindi, la chiave per comprendere il percorso di TCR di segnalazione così come la sua regolamentazione attraverso vie di segnalazione di altri. Un sistema modello molto utile per studiare segnalazione avviata dal TCR a livello della membrana plasmatica di cellule T è vetro supportate bistrati lipidici, come descritto in precedenza 5-6. Possono essere utilizzati per presentare pMHC complessi antigenici, adesione, e molecole co-stimolatorie di cellule T-serve come APC artificiali. Con imaging delle cellule T interagendo con labistrato lipidico totale utilizzando microscopia a fluorescenza riflessione interna (TIRFM), possiamo limitare la eccitazione di 100 nm all&#39;interno dello spazio tra il vetro e la superficie cellulare 7-8. Questo ci permette di immagine in primo luogo gli eventi di segnalazione che si verificano a livello della membrana plasmatica. Come ci interessa nell&#39;imaging l&#39;assunzione di proteine ​​di segnalazione al complesso TCR, descriviamo due telecamera TIRF sistema di imaging in cui il TCR, marcato con Fab fluorescente (frammento legante l&#39;antigene) frammenti di anticorpo H57 (purificato da ibridoma H57-597 , ATCC, ATCC Number: HB-218) che è specifico per TCRβ, e proteine ​​di segnalazione, etichettato con GFP, può essere ripreso simultaneamente e in tempo reale. Questa strategia è necessaria a causa della natura altamente dinamica sia delle cellule T e degli eventi di segnalazione che si verificano al TCR. Questa modalità di imaging ha permesso ai ricercatori di ligandi di immagini singole 9-11, nonché all&#39;assunzione di molecole di segnalazione ai recettori attivati ​​eè un sistema eccellente per studiare biochimica in-situ 12-16.

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

La compartimentazione delle proteine ​​sia all&#39;interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

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Immunology and Infection

23.7K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applic...

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine associate segnalazione