本研究では、アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所の学内研究部門によってサポートされていました。我々は、これらの研究で使用されているH57のscFvをご提供するためのヨハネスHuppa、マーク·デイビスに感謝しています。 RVは、この手法の開発中に有用な議論のためのキア·ノイマンに感謝します。

<ol>
	<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor:+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function.">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.T+cell+activation.">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways.">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li><li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+network:+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells.">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li><li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li><li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling.">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li><li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor.">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li><li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling.">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li><li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses.">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li><li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse.">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li><li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse.">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7:+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events.">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li></ol>

これらの実験で使用されているすべての動物は特定病原体フリーの環境で維持され、実験は、健康動物のケアおよび使用委員会の国民の協会によって承認されました。

ここではTIRFMと人工APCのようなガラスサポート脂質二重層を用いた抗原特異的なマウスの主要T細胞のシグナル伝達を勉強するようにシステムを説明します。技術は、正常にこれらの細胞でGFPタグ融合タンパク質を発現しているに依存しています。 T細胞をトランスフェクションは、常に困難な作業です。一般的に、レトロウイルスやレンチウイルスを用いたエレクトロポレーション、または遺伝子送達が使用されています。一つの技術は他よりも優れたではありません。両方がそれらの限界と利点を持っています。 1）それは、レトロではなくレンチウイルスのために要求されるように細胞が活発に分裂することを要求され​​ない、2）の発現レベルは細胞がイメージングの前にインキュベートされる時間を変えることによって制御することができます：我々は、エレクトロポレーションは、次のような利点があります見つける。最大の欠点は、我々はそれが非常に困難な初代培養細胞のサイズが大きいタンパク質を発現することを見つけることです。我々は、エレクトロポレーション後、私達に非常に優れた細胞の生存を与える方法を提案した。結果としてそれがapplicabです。siRNAを介した遺伝子サイレンシングを達成するためにそれを使用するル。 また、ここで色収差補正されており、異なる波長ごとに個別のアライメントを必要としないカスタマイズされた2チャンネル同時取得TIRF顕微鏡を説明します。これらの機能はあるが、市販されている。私たちのシステムは、全反射顕微鏡分野の専門家によって発行され、商業の選択肢よりも安価であるの原則に基づいています。私たちのデザインの一つの可能​​な批判は、我々は、異なる励起波長の入射角度と同じを使用していることです。これは、異なる励起波長の異なる全反射侵入深さをもたらすでしょう。我々は、エバネッセント波は指数関数的に減衰するフィールドであり、全反射、被写界深度は、波長の線形関数であるため、これらの影響は小さいと考えています。ガラス表面に近い蛍光体は、2つの波長間でのレーザー強度の差を体験しません。 PEの近くに蛍光体のためにnetrationの深さは、強度の違いは、2つの波長488と640nmの1.3倍、二つの波長488と561 nmの1.15倍となります。同じシステムは、全反射照明を利用して超解像技術と組み合わせて使用​​することができます。 また、カスタム構築されている二つのカメラシステムを記載している。 TIRFシステムと同様に、類似した装置も市販されている。我々のシステムは、波長の異なる組み合わせでの使用を許可し、フィルタとdichroicsを変更する柔軟性を提供します。我々のシステムの欠点は、2つの画像を整列するために必要な回転の1程度である。この問題は、ピエゾ駆動アライメントの回転度を提供しているカメラスタンドを使用することで解決できます。我々はまた、成功したカメラが異なっていて、別のピクセルサイズを持っているでは、この顕微鏡に2つのカメラシステムを導入しています。一つ一つのチャネルの感度と大きなdyを必要に応じてこのようなシステムが有用であろう別のnamic範囲は、どちらも同じカメラではほとんど利用できません。私たちは私たち16μmのピクセルサイズを持つPhotometricsクワント-EMのカメラで12.9μmの有効画素サイズを与える2x2ビニングでPhotometrics HQ-2カメラを使用していました。 180ミリメートルの焦点距離チューブレンズはクワント-EMに使用されたと145ミリメートルの焦点距離チューブレンズはHQ-2カメラを使用しました。 HQ-2はMetamorphソフトウェアを使用して制御されたとクワント-EMは、外部トリガ·モードで別のコンピュータにマイクロ·マネージャー·ソフトウェアを介して制御されていました。外部トリガは、Metamorphのconfigure照明の設定で追加のシャッターとして実装された測定·コンピューティングのDACボードのデジタル出力を使用してクワント-EMカメラに提供されていました。チューブレンズの焦点距離の比は、有効画素サイズの比率と一致しています。代表的なアラインメントを図5に示します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>マウスT細胞のAmaxaのNucleofectorキット</td><td>ロンザ社</td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPureプラスミドミディプレップキット</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> K2100-05 </td><td>エンドトキシンフリーのDNAプレップ用</td></tr><tr><td> AmaxaのNucleofectorデバイス</td><td>ロンザ社</td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-2 </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 212から12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescentミクロスフェア0.20μm </td><td>ポリサイエン株式会社</td><td> 24050から5 </td><td></td></tr><tr><td>ラボ·テックII 8ウェルチャンバーカバーガラス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ヌンク</td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a tirf microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the tcr and its associated signaling proteins

それは主要組織適合遺伝子複合体（pMHC）抗原提示細胞（APC）の表面に発現したタンパク質によって結合した抗原ペプチド断片によって従事しているときにシグナルがT細胞受容体（TCR）を介して開始されます。 TCR複合体はCD3二量体（εδとεγヘテロとホモ二量体ζζ1）を関連付ける非共有結合的にそのリガンド結合TCRαβヘテロで構成されています。受容体の関与すると、CD3ζ鎖はLckは、Srcファミリーキナーゼによってリン酸化されています。そして、これはLckがによってリン酸化と活性化されるSykの家族キナーゼ、ZAP70の採用につながります。その後、ZAP70は、さまざまなシグナル伝達分子が多数の2を含む近位シグナル伝達複合体の形成を開始し、アダプタータンパク質LATとSLP76をリン酸化する。 カルシウムは、この複雑な最終的に結果の形成​​とRas依存TRAnscription因子の活性化とT細胞の分化2に上昇を与える遺伝子発現プログラムの複雑な一連の結果開始。 TCR信号（および分化の結果の状態）は、抗原の効力とクロストークco-stimulatory/co-inhibitoryと、ケモカイン、および3-4のサイトカイン受容体を含む他の多くの要因によって変調されています。さまざまな刺激条件下での近位シグナル伝達複合体の空間的および時間的な組織を研究することは、従って、TCRシグナル伝達経路だけでなく、他のシグナル伝達経路によるその調節を理解する鍵となります。 以前は5-6を説明したようにT細胞の細胞膜でTCRによって開始されたシグナル伝達を研究するための一つの非常に有用なモデルシステムは、ガラスでサポートされている脂質二重層である。彼らは人工的なAPCのようにT-サービングセルに抗原pMHC複合体、接着性、共刺激分子を提示するために利用することができる。撮像することによってT細胞と相互作用する内部全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を使用して、脂質二重層は、我々は7-8ガラスと細胞表面との間の空間の中では100nmに励起を制限することができます。これは、私たちは主に画像細胞膜で起こるシグナル伝達イベントをすることができます。我々はイメージングにTCR複合体にシグナル伝達タンパク質の募集に興味を持っているように、我々はH57抗体の蛍光灯のFab（フラグメントの抗原結合）断片（ハイブリドーマから精製されたH57-597で標識された、前記TCR 2つのカメラTIRFイメージングシステムを記述する、ATCC、ATCC番号：HB-218）TCRβのために固有のものであり、GFPでタグ付けシグナル伝達タンパク質は、同時に、リアルタイムでイメージングすることができます。この戦略は、T細胞の両方とTCRで行われているシグナル伝達事象の非常に動的な性質のために必要である。この画像診断法は、画像、単一のリガンド9月11日と同様に活性化受容体へのシグナル伝達分子の募集に研究を許可していると12月16日 in-situで生化学を勉強するための優れたシステムです。

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

a-tirf-microscopy-technique-for-real-time-simultaneous-imaging-tcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.7K ビュー.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明します...