Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Heilungszustände während der Leishmanien-Interaktion mit den Wirtszellen zu bewerten. Diese Technik stellt sich als Hauptvorteil dar und ermöglicht die Untersuchung verschiedener Zustände der Leishmania-Phagozytose und die Teilnahme mehrerer Proteine.
Es ist erwähnenswert, dass diese Technik auch auf andere Arten von Studien ausgedehnt werden kann, einschließlich Infektionen durch Bakterien, Hefen oder Verschlingen durch andere Arten von Zellen. Menschen, die diese Technik ausprobieren, sollten auf die Expositionszeit der Zellen gegenüber der Nucleofector-Lösung achten. Darüber hinaus empfehlen wir, die Transfektion mit maximal zwei Plasmiden zu testen.
Amanda Reboucas, Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Zunächst werden 0,2 Millionen THP-1-Zellen oder menschliche Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 Mikrolitern U/min pro Vertiefung auf einer 24-Well-Platte mit 13-Millimeter-Glasdeckgläsern ausgesät. Inkubieren Sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid, waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% Kochsalzlösung und inkubieren Sie die Zellen in einem Complete RPMI Medium.
Fügen Sie stationäre Phasen-Leishmania-Arten zu den Zellen bei einem 10-Parasiten-Verhältnis zu einem Wirtszellverhältnis hinzu und zentrifugieren Sie dann bei 720 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% Kochsalzlösung, um nicht internalisierte Promastigoten zu entfernen. Inkubieren Sie die Zellen in ergänztem RPMI-Medium bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und fixieren Sie dann die Zellen mit 4% PFA für 15 Minuten.
Als nächstes montieren Sie Deckgläser mit bevorzugten Montagemedien. Dann zählen Sie mindestens 400 Zellen in zufälligen Feldern unter einem Fluoreszenzmikroskop. Um die Leishmanien-induzierte PV-Biogenese zu untersuchen, beginnen Sie mit der Transfizierung von THP-1-Zellen mit Plasmid, indem Sie 15 Millionen THP-1-Zellen in 75 Quadratzentimeter große Gewebekulturkolben mit 10 Milliliter Complete RPMI Medium mit 100 Nanogramm pro Milliliter PMA und 50 Mikromolar zu Mercaptoethanol für 48 Stunden aussäen.
Dann waschen Sie die Zellen einmal in 0,9% Kochsalzlösung und lösen Sie die Zellen mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung. Dann zentrifugieren Sie bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes resuspendieren Sie die THP-1-Zellen in einem Milliliter RPMI Medium und führen Zählungen in einer Neubauer-Kammer durch.
Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 250 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie 2 Millionen Zellen in 100 Mikroliter Nucleofector-Lösung und inkubieren Sie mit 0,5 Mikrogramm der Plasmidbeschichtung für das interessierende Protein, markiert mit einem fluoreszierenden Protein. Die Suspension, die THP-1-Zellen und Nukleinsäure enthält, wird in die Nucleofector-Küvette überführt.
Transfizieren Sie dann die Zellen mit dem Nucleofector-Programm Y one. Gewinnen Sie die transfizierten Zellen und Samen in 500 Mikrolitern RPMI Medium auf 24 Well-Platten mit 13-Millimeter-Glasdeckgläsern. Inkubieren Sie die Zellen und Complete RPMI Medium bei 37 Grad Celsius für 0,5, 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden.
Lassen Sie die 13 Millimeter Glasdeckgläser bei Raumtemperatur stehen und schützen Sie sie mindestens 30 Minuten vor der Aufnahme vor dem Licht. Reinigen Sie die Deckgläser mit saugfähigem Tuch. Als nächstes fügen Sie einen Tropfen Tauchöl zum Objektiv hinzu und fügen Sie dann die Folie hinzu.
Bewegen Sie das Objektiv nach oben, bis das Öl den Objektträger berührt. Beobachten und stellen Sie den Fokus auf dem Mikroskop ein und wählen Sie die Option 63x Objektiv mit Öl. Öffnen Sie das LIQA-Programm und stellen Sie die Laser in den Wellenlängen 488, 552 und 405 ein.
Wählen Sie die Bildauflösung als 1024 x 1024. Nachdem Sie auf den Live-Button geklickt haben, stellen Sie den Z-Stack ein und drücken Sie die Startoption. Warten Sie auf die Bildaufnahme und wählen Sie dann die Option Maximale Projektion in den Werkzeugen aus.
Speichern Sie das Experiment, und exportieren Sie die Bilder im TIFF-Format auf einen Computer. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl Leishmania Braziliensis LCL als auch Leishmania Braziliensis DL in ähnlicher Weise an Makrophagen binden. Auch wurden keine Unterschiede in Bezug auf Leishmania Braziliensis LCL und Leishmania Braziliensis DL Phagozytose durch Wirtszellen beobachtet.
Die Rekrutierung von LC3 für die parasitophore Vakuole oder PV, induziert durch Leishmania Braziliensis LCL oder Leishmania Braziliensis DL, wurde in infizierten Zellen verglichen. Nach vier Stunden Infektion wurden ähnliche Prozentsätze von LC3-dekorierten PVs in Leishmania Braziliensis LCL und Leishmania Braziliensis DL infizierten Makrophagen beobachtet. So zeigten die Ergebnisse, dass Leishmania Braziliensis LCL und Leishmania Braziliensis DL in ähnlicher Weise mit Makrophagen während der Bindung, Phagozytose und Biogenese von PVs in Bezug auf die LC3-Rekrutierung interagieren.
Repräsentative mikroskopische Bilder zeigten eine effiziente Transfektion von THP-1-Zellen mit PLC-GFP-, Rab5-GFP- und Rab7-GFP-Plasmiden. Menschen, die dieses Protokoll ausprobieren, müssen auf die Temperaturinkubation achten und die Mikroskopproben vor dem Licht schützen, alle Arten. Die Modulation der Expression der identifizierten Proteine, die die Leishmanien-Phagozytose auslösen, wird die Bedeutung dieser Proteine für das Ergebnis der Leishmanien-Infektion demonstrieren.
Wir können diese Technik auf verschiedene Arten von pathologischen Studien und Mechanismen im Zusammenhang mit der Parasitenetablierung und Zielidentifizierung für die Entwicklung therapeutischer Strategien ausdehnen.
