Die Autoren danken dem Land Baden-Württemberg und die Europäische Union Europäischer Fonds für regionale sterben Entwicklung - für die Finanzierung ZAFH-PHOTON n, das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) für die Finanzierung von Forschung Grant No. 1792C08 sowie die Baden-Württemberg-Stiftung GmbH für die Finanzierung des Projekts &quot;Aurami&quot;.

Ein. Seeding und Inkubation der Zellen <ol><li> Saatgut einzelnen Zellen, zB U373-MG oder U-251 MG-Glioblastomzellen mit einer typischen Dichte von 100 Zellen / mm 2 auf einem Glasträger und wachsen sie für 4872 Stunden in Kulturmedium (zB RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika) mit einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Inkubieren von Zellen mit einer Membran-Marker, zB 6-Dodecanoyl-2-dimethylamino Naphthalin (Laurdan) für 60 min bei einer Konzentration von 8 uM (in Kulturmedium) 4, oder eines Cytoplasma-Marker aufgebracht, angewendet zB Calcein acetomethlyester 40 min bei einer 4,5; Konzentration von 5 uM 3, oder eine Membran zugeordnet Photosensibilisator Protoporphyrin IX z. B. auf 4 h Inkubation mit seiner Vorstufe 5-Aminolävulinsäure (1 mM 5-ALA) induziert. </li><li> Waschen der Zellen mit Kulturmedium oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vor der Fluoreszenzmikroskopie. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Verwenden Sie einen aufrechten Mikroskop, z. B. Zeiss Axioplan, und ersetzen Sie ihre Kondensator durch eine Beleuchtungseinrichtung, wie in Lit. beschrieben. 3 mit einer halbkugelförmigen oder halbzylindrischen Glasprisma optisch mit dem Objektträger verbunden (siehe Abbildung 1). </li><li> Verwenden eines parallelen kollimierten Laserstrahls das nach Abbildung durch das Glasprisma und weitere optische Komponenten (zB Hohlspiegel) resultiert wiederum in einer parallelen Strahls auf der Oberfläche der Probe (telezentrische Pupille ray). Achten Sie darauf, dass der elektrische Feldvektor senkrecht polarisiert sind zu der Einfallsebene ist. </li><li> Verwenden einer einstellbaren Spiegel innerhalb des Kondensators, der in der Probe abgebildet wird und beleuchtet die Probe unter einem variablen Anstellwinkel (Objektstrahl) befindet. Die verstellbare Spiegel kann durch einen Schrittmotor angetrieben werden, wobei jede Position einem gut definierten Einfallswinkel, wie durch Messungen goniometrischen 3 bestimmt </sup&gt;. </li><li> Kalibrieren der Winkelposition des verstellbaren Spiegels mit dem kritischen Winkel Θ c = 61,3 ° für ein Glas-Wasser-Übergang als ein fester Wert. Θ c visualisiert werden bei Variation der Θ wenn ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. 1 mM Flavinmononucleotid, FMN) in Wasser gelöst ist. Die Position des Spiegels bei Θ = Θ c ist in dem Spiegel Positionierprogramm gespeichert. </li><li> Stellen Sie die Parameter der Kamera (hinten beleuchtet Andor Ixon EMCCD, DV887DC, Andor Technology, Belfast, UK 6), einschließlich Temperatur, Verstärkung, Aufnahmezeit und Schaltgeschwindigkeit. </li><li> Verwenden Sie ein Objektiv von geeigneten Vergrößerung und bevorzugt moderate numerische Apertur (z. B. 40 × / 0,75 oder 63 × / 0,90 Eintauchen in Wasser) und lokalisieren Sie die Objektträger unter dem Mikroskop. Verwenden Immersionsöl, um optischen Kontakt der Probe mit dem Glasprisma gewährleisten. Aufzuzeichnen Fluoreszenzbilder von identischen Proben auf die VariationBeleuchtungswinkel (Θ ≥ Θ c mit Θ c entspricht 64,5 ° für eine Zell-Glas-Grenzfläche). Ein Winkelbereich von 66 ° -74 ° in Schritten von 0,5 ° oder 1 ° empfohlen. Verwenden ein geeignetes Langpass oder Bandpassfilter zum Fluoreszenzdetektion. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Lesen von Bildern (zB im ASCII-Format) in verschiedenen Winkeln Θ sowie den Kameraeinstellungen (für Hintergrund Diskriminierung), der Anregungswellenlänge und den Brechungsindizes für Glas (n 1 = 1,52) und Zellen aufgenommen (n 2 = 1,37) in die Auswertung Programm (LabView; NanoCell). Für jeden Satz von Parametern die Eindringtiefe d (Θ) und der Transmissionsgrad T (Θ) werden automatisch berechnet. </li><li> Wählen Sie die Bilder zur Auswertung von Zell-Substrat-Distanzen Δ nach Gleichung 5 (Membran Marker) oder Gleichung 4 (Zytoplasma Marker), Einzelne Bilder mit inhomogenerBeleuchtung (aufschlussreiche e, g. Streifen) kann ausgeschlossen werden. </li><li> Berechnen Sie Bilder von Zell-Substrat-Topologie und wählen Sie einen geeigneten Farbcode für die Anzeige. Bei der Auswertung Profile der einzelnen Pixel dargestellt werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese Profile können als Indikator für die Qualität der Anpassung verwendet werden. </li><li> Bewahren Sie die Auswertung Protokoll. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Vertreter Experimente mit gentechnisch veränderten U251-MG Glioblastom-Zellen freundlicherweise von Prof. Jan Mollenhauer, Abteilung Molekulare Onkologie, Universität Süddänemark, Odense zugeführt wird. In zwei Subklone dieser U251 Zellen die Tumorsuppressorgene oder TP53 PTEN sind überexprimiert Verwendung eines Tet-On Induzierbares Expressionssystem, derart, dass diese Zellen einen verminderten tumorigene Potential aufweisen und können als weniger malignen anzusehen. Hochmalignen U251-MG Zellen ohne Suppressor-Gen sind als Kontrollen verwendet, und U251-MG Wildtyp-Zellen dienen einem weiteren Vergleich. Eine Laserdiode Emittieren eines quasi kontinuierliche Reihe von Pikosekundenpulse (LDH400 mit Treiber PDL 800-B, PicoQuant, Berlin, Deutschland; Wellenlänge: 391 nm; Pulsenergie: 12 PJ; Wiederholungsrate: 40 MHz) als Anregungsquelle verwendet. In 3 TIRFM Bilder der U251-MG Glioblastomzellen mit einer aktivierten TP53 Tumorsuppressorgens und inkubiert mit Laurdan (8 uM, 60 min) werden für Einfallswinkel von 66,0 °, 69,0 ° und 73,0 ° entsprechend Eindringtiefen der abgebildete evaneszenten elektromagnetischen Feld von etwa 140 nm, 75 nm und 60 nm aufweisen. Mit abnehmender Eindringtiefe Fluoreszenz Intensität abnimmt (siehe Skalen) und stammt aus oberflächlicher Seiten der Zellen (zB fokalen Kontakten auf ihren Kanten). Zell-Substrat-Abstände (visualisiert in Abbildung 3d durch einen Farbcode zwischen 0 bis 600 nm) stark in den Zellen zwischen auf unterschiedlichly wenige Nanometer (weiß-gelb) und 250-300 nm (dunkelrot), dh fokale Kontakte und größere Zell-Substrat-Abstände sind in unmittelbarer Nähe. Das gleiche gilt für U251-MG Glioblastomzellen mit einer aktivierten Suppressorgen PTEN (4d), während Zell-Substrat-Abstände relativ konstant sind für U251-MG-Steuerung und Wildtyp-Zellen mit typischen Werten von 80 bis 100 nm (gelb; 4b ) und 150-200 nm (orange-rot; Abbildung 4a). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beleuchtungseinrichtung für VA-TIRFM in einem aufrechten Mikroskop. Eine einstellbare Spiegel durch einen Schrittmotor angetrieben erlaubt eine Winkelauflösung von ± 0,25 °. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Abbildung 2. Auswertung Profil für ein pixel (schematisch). Wenn ln [I C / T (Θ)] in Abhängigkeit von 1 / d (Θ) aufgetragen ist, stellt die Steigung der Zell-Substrat-Abstand Δ. Diese Steigung wird üblicherweise mit einer Genauigkeit von etwa ± 10% bestimmt. Ein Wert - resultierend aus inhomogenen Beleuchtung - markiert wurde und ausgeschlossen von der Auswertung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Abbildung 3 TIRFM Bilder der U251-MG Glioblastomzellen mit aktivierten TP53 Suppressorgen nach Inkubation mit Laurdan (8 uM, 60 min). Aufgezeichnet bei verschiedenen Beleuchtungswinkeln (ac); Zell-Substrat-Abstände im Bereich von 0-600 nm gezeigten durch einen Farbcode (d); Anregungswellenlänge: 391 nm, Detektion: ≥ 420 nm; image size:. 210 &amp;mgr; m × 210 &amp;mgr; m <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Abbildung 4 Zell-Substrat-Abstände von U251-MG glioblatoma Zellen im Bereich von 0-600 nm durch einen Farbcode gezeigt;. (A) Wildtyp (b) steuert, (c) Zellen mit aktivierten Suppressorgen TP53, (d) Zellen mit aktiviertem Suppressor-Gen PTEN; Anregungswellenlänge: 391 nm, Detektion: ≥ 420 nm; image size:. 210 &amp;mgr; m × 210 &amp;mgr; m <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Es wird ein Verfahren zum Messen Zell-Substrat-Abstände mit Nanometer-Präzision beschrieben. Derzeit Methoden der super-hochauflösenden Mikroskopie, zB auf strukturierte Beleuchtung 7 oder auf Einzelmoleküldetektion 8-10 sowie stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie 11 sind von großem Interesse basiert. Keine dieser Techniken erlaubt jedoch eine axiale Auflösung unterhalb von 50 nm aufweist. Darüber hinaus relativ hohe Bestrahlungsstärke von 50100 W / cm 2...

Wenn ein Lichtstrahl durch ein Medium ausbreitet der Brechungsindex n 1 eine Schnittstelle erfüllt, um ein zweites Medium mit einem Brechungsindex n 2 &lt;n 1 tritt Totalreflexion an alle Einfallswinkel Θ, der größer als der kritische Winkel Θ c = sind arcsin (n 2 / n 1). Obwohl sie total reflektiert das einfallende Lichtstrahl Wucht einem evaneszenten elektromagnetischen Felds, das in das zweite Medium und nimmt exponentiell mit senkrechten Abstand z von der Grenzfläche eindringt gemäß I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) entspricht der Intensität des elektromagnetischen Feldes und d (Θ) zu der Eindringtiefe bei der Wellenlänge λ, wie gegeben durch d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Wie in der Literatur 1,2 berichtet, 0 I </ssub&gt; entspricht der Intensität des einfallenden Lichts I e mit der Transmissionsfaktor T (Θ) und dem Verhältnis n 2 / n 1 multipliziert. Wenn der elektrische Feldvektor des Lichts polarisiert ist senkrecht zur Einfallsebene (dh die Ebene, die durch den einfallenden und den reflektierten Strahl aufgespannten) wird diese Transmissionsfaktor gegeben durch T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [ein - (n 2 / nL 1) 2] Für den erfassten Fluoreszenzintensität in TIRFM Messungen hat Lichtabsorption, über alle Schichten der Probe integriert werden und multipliziert mit der Fluoreszenzquantenausbeute η des jeweiligen Farbstoff sowie mit der Raumwinkel Ω Detektion. Wie bereits berichtet 3, kann diese Intensität beschrieben werden durch I F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz wenn alle Faktoren f die unabhängig sind<html> rom der Einfallswinkel Θ und die Koordinate z innerhalb des experimentellen konstanten A. Gleichung 3 enthalten kann analytisch gelöst werden, wenn die Konzentration c (z) von Fluorophoren vorliegt, gilt als nahezu konstant - Entweder überhaupt Koordinaten z ≥ Δ, im Zytoplasma von Zellen mit einem Abstand Δ von der Schnittstelle zB. In diesem Fall weist das Integral von z = Δ bis z = ∞ was zu berechnen I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Oder zwischen z = Δ - t / 2 und z = + Δ t / 2, dh innerhalb einer dünnen Schicht mit einer Dicke t, zB einer Zellmembran in einem Abstand Δ von der Schnittstelle angeordnet ist. In diesem Fall kann die Fluoreszenzintensität berechnet werden als I F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ) wenn t im Vergleich mit Δ klein. ent &quot;&gt; Aus den Gleichungen (4) und (5) Zell-Substrat-Abstände Δ berechnet werden, wenn die Bilder der Fluoreszenzintensität I F für variable Winkel Θ aufgezeichnet werden, und wenn ln (I F / T d) (Gl. 4) oder ln (I F / T) (Gl. 5) als Funktion von 1 / d für diese Winkel ausgewertet. Für die Membran Marker Laurdan in diesem Papier verwendet (s. unten) die Auswertung nach Gl. 5 durchgeführt wurde. Wie bereits berichtet 3, Bildaufnahme und Auswertung benötigt - Homogene Verteilung von Anregungslicht über die Probe, - Gültigkeit einer 2-Schichten-Modells (mit den Brechungsindizes n 1 und n 2 für das Substrat und das Zytoplasma, jeweils). Dies gilt, wenn die Plasmamembran ist sehr dünn, und wenn die Schicht aus dem extrazellulären Medium (zwischen der Zelle und dem Substrat) klein ist im Vergleich zur Wellenlänge des einfallenden Lichts. Zusätzlich kann eine moderate numerische Apertur(Typischerweise A ≤ 0,90) des Mikroskops Objektivlinse ist vorteilhaft, Abweichungen der Helligkeit aufgrund Anisotropie von Strahlung im nahen Feld des Dielektrikum-Grenzfläche zu vermeiden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Typ </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Nunc </td><td> Nunc CELLSTAR QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminar Flow </td><td> Holten Sichere </td><td> S2010 1,2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% Penicillin / Streptomycin </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> Kultivierungsmedium </td></tr><tr><td> Glas Objektträger </td><td> Marienfeld </td><td> Reines weißes Glas </td><td> Spezialreinigung Verfahren verwendet </td></tr><tr><td> 6-Dodecanoyl-2-dimethylamino Naphthalin (Laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Fluoreszierenden Marker (Stammlösung: 2 mM in Ethanol) </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Laserdiode </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 mit Fahrer PDL 800-B </td><td> Wellenlänge: 391 nm </td></tr><tr><td> Singlemode-Faser-System </td><td> Point Source </td><td> kineFlex </td><td> Wird mit Kollimationsoptik </td></tr><tr><td> EMCCD-Kamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Kamera hinten beleuchtet </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Oberflächentopologie, z. B. von Zellen wachsen auf einem Substrat, mit Nanometer-Präzision durch unterschiedlichen Winkeln Total Internal Reflection-Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM) bestimmt. Zellen werden auf transparente Folien kultiviert, gewaschen und mit einem fluoreszierenden Marker homogen in ihrem Plasma Membran verteilt. Beleuchtungssystem tritt durch einen parallelen Laserstrahl unter variablen Winkeln der inneren Totalreflexion (TIR) ​​mit unterschiedlichen Eindringtiefen der evaneszenten elektromagnetischen Feldes. Aufzeichnung von Bildern bei Bestrahlung Fluoreszenz bei etwa 10 unterschiedlichen Winkeln ermöglicht, Zell-Substrat-Abstände mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern berechnen. Unterschiede der Haftung zwischen verschiedenen Zelllinien, zB Krebszellen und weniger malignen Zellen werden somit bestimmt. Darüber hinaus können eventuelle Änderungen der Zelladhäsion auf chemische oder photodynamischen Behandlung geprüft. Im Vergleich mit anderen Methoden der super-hochauflösenden Mikroskopie Belichtung gehalten wirdsehr klein, und keine Beschädigung der lebenden Zellen erwartet wird.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologie der Zelladhäsion auf einem Substrat mit Nanometer-Präzision durch verstellbarem Winkel Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM) gemessen.

Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K Aufrufe.  Institut für Angewandte Forschung. Topologie der Zelladhäsion auf einem Substrat mit Nanometer-Präzision durch verstellbarem Winkel Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM) gemessen.

Serie: Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Forschung

Biotechnik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly interesting for already approved polymers that have a long standing use in medicine because these materials are well characterized and legal issues associated with the introduction of newly synthesized polymers may be avoided. Polytetrafluoroethylene (PTFE) is one of the most frequently employed materials for the manufacturing of vascular grafts but the polymer lacks cell adhesion promoting features. Endothelialization, i.e., complete coverage of the grafts inner surface with a confluent layer of endothelial cells is regarded key to optimal performance, mainly by reducing thrombogenicity of the artificial interface.
This study investigates the growth of endothelial cells on peptide-modified PTFE and compares these results to those obtained on unmodified substrate. Coupling with the endothelial cell adhesive peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) is performed via activation of the fluorin-containing polymer using the reagent sodium naphthalenide, followed by subsequent conjugation steps. Cell culture is accomplished using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and excellent cellular growth on peptide-immobilized material is demonstrated over a two-week period.

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Nasschemie und Peptid Immobilisation auf Polytetrafluoroethylen für verbesserte Zellhaftung

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...