Wir danken Fiona Foley für exzellente lab Unterstützung und Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde eine AHA Promotionsstipendium GW (11PRE5730027) und NHLBI Zuschüsse HJY (R01HL66292) und JDA (R01HL095690) unterstützt.

Übersicht der Stage-Specific Zebrafisch Embryo Injections Antisense Oligonukleotide Morpholino (MO), die zu einer gezielten mRNA binden und stören Proteinexpression von diesem Transkript, sind weit verbreitet in Knockdown Gen verwendet (Loss-of-function) Studien im Zebrafisch 13,14. Gene Tools, LLC bietet MOs, die entweder mit Carboxyfluorescein (emittiert grüne Fluoreszenz) oder Lissamin (emittiert rote Fluoreszenz) getaggt sind, MO in injizierten Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie zu erkennen. Durch Einspritzen von MO in den Dotter Zelle in verschiedenen Stadien des Zebrafisches Entwicklung ist es möglich, die MO nach bestimmten Kompartimenten des Embryos (1A-F) zu liefern. MO in den Dotter zwischen den Zellstadien 1-4 (0-1 hpf) tritt alle embryonalen Zellen (1A, D, D &#39;) über die Anschlüsse, die mit dem Eigelb, bis das 32-Zellen-Stadium 15 globalen Knockdown erleichtern fortbestehen injiziert. MO injiziert in den Dotter in midblastula Stufen (2.5-3 hpf) können die Vorfahren der DFCs (1B, E, E &#39;) wahrscheinlich durch cytoplasmatische Brücken 8 und knockdown Genfunktion speziell in der DFC / KV Zelllinie 12, ohne Eingabe meisten anderen embryonalen Zelllinien geben . Als wichtige Kontrollfunktion zu testen, ob Genfunktion in DFC / KV oder auch im Eigelb 12,16 erforderlich ist, ist es auch möglich, MO nach dem Eigelb-Zelle zu beschränken durch Einspritzen zwischen den kuppelartigen 30% epiboly Stufen (~ 4,5 hpf) nach alle zytoplasmatische Brücken geschlossen (1C, F, F &#39;). Diese Injektionen wurden in Kombination verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen 17-24 analysieren. Um den Fluidstrom in KV beurteilen, werden fluoreszierenden Mikrokugeln in das Lumen zwischen den KV 6-10 somite Stufen (12-14 hpf) abgebildet und dann sofort mit Videomikroskopie (Abbildungen 1G-J). Eingespritzt Mikroperlen sind verfügbar, rot oder grün emittieren Fluoreszenz (oder beides), so ist es möglich, unterschiedliche verwendenKanäle Bild fluoreszierenden Mikrokügelchen und MO. Ein. Stage-spezifische Injektion von Morpholinos (MO) Die Injektion von MO in Zebrafisch-Embryonen wurde zuvor 25,26 demonstriert. Hier beschreiben wir kurz stage-spezifische MO-Injektionen. Nach aller Injektionen, werden Embryonen in eine Petrischale überführt und bei 28,5 ° C. <ol><li> Globale MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und laden Sie sie in einer Injektion Platte. Legen fluoreszierende MO in eine Kapillare Nadel und montieren Sie die Nadel auf einer Mikroinjektor (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor). Brechen die Nadelspitze und justieren Injektionseinstellungen (Druck und / oder Zeit), um eine Injektion Tropfen, der ein Volumen von 1 nl beschriebenen 25,26 weist erstellen. Verwenden eines Sezieren Stereomikroskop injizieren 1 nl von MO in den Dotter (1A) von ≥ 50 Embryonen pro Versuch. Arbeiten Sie schnell zu Injektionen mit dem 4-Zellen stag abzuschließenE. </li><li> DFC-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und bei 28,5 ° C inkubieren Wenn die Embryonen haben die 256-Zell-Stadium (~ 2,5 hpf) erreicht, schnell laden Sie sie in einer Injektion Platte und dann spritzen 1 nl von fluoreszierenden MO in den Dotter von ≥ 100 Embryonen zwischen den 256-Zell-und 1.000-Zell-Stadium (Abbildung 1B). </li><li> Yolk-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und inkubieren bei 28,5 ° C. Auf die Kuppel Stufe (~ 4 hpf), laden die Embryonen in eine Einspritzplatte und dann einzuspritzen 1 nl fluoreszierender MO im Eigelb von ≥ 100 Embryonen zwischen der Kuppel und 30% epiboly Stufen (Abbildung 1C). </li></ol> 2. Auswahl injizierten Embryonen für die Analyse <ol><li> Wenn MO Embryonen erreichen die 75%-epiboly Stufe (8 hpf) eingespritzt wird, zu entfernen und tote unbefruchteten Eizellen und dann Bildschirm lebenden Embryonen unter Fluoreszenz Präpariermikroskop zur Verteilung der fluoreszierenden MO. Dann allow gewählt Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C. <ol><li> Für globale MO-Injektionen, wählen Embryonen, die Fluoreszenz gleichmäßig in in allen embryonalen Zellen (Abbildung 1D; 2A) verteilt. </li><li> Für gezielte DFC-MO Injektionen, auszuwählen, in denen Embryonen fluoreszierende MO gesamten Dotter diffundiert ist und scheint an der dorsalen Blastoderm Marge (DFCs) (1E; 2B) eingeengt. In dieser Phase kann es schwierig sein, fluoreszierenden DFCs durch helle Fluoreszenz in der darunterliegenden Dotter visualisieren. Achten Sie darauf, Embryonen, in denen das fluoreszierende MO in embryonale Zellen außer DFCs eingebaut wurde oder bleibt aggregiert an der Injektionsstelle (Abbildung 2D) auszuschließen. </li><li> Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, in denen MO Fluoreszenz gleichmäßig über das Eigelb verteilt wird und nicht in einem embryonalen Zellen (1F, 2C) beobachtet. Wiederum entfernen Embryonen in der die fluoreszierende MO bleibtaggregiert an der Injektionsstelle. </li></ol></li><li> Zwischen den 2-4-somite Stufen (~ 11 hpf), Embryonen Bildschirm ein zweites Mal unter einem Fluoreszenzmikroskop mit stärkerer Vergrößerung. Dann lassen ausgewählten Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C. <ol><li> Für globale MO Injektionen, sicherzustellen ausgewählten Embryonen MO Fluoreszenz gleichmäßig in KV und alle embryonalen Zellen (1D &#39;; Abbildung 2E) verteilt. </li><li> Für DFC-gezielte MO Injektionen, sorgfältig auszuwählen Embryonen, MO Fluoreszenz nur in KV-Zellen und das Eigelb (1E) haben. Transgenen Embryos, die Ausdruck GFP in KV Zellen wie Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, bei der Identifizierung von Embryonen in der MO erfolgreich an KV Zellen (2F) geliefert unterstützen kann. Verwerfen von Embryonen mit MO Fluoreszenz in embryonalen Zellen anderen, dass KV-Zellen. </li><li> Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, die MO-Fluoreszenz haben ausschließlich im Eigelb (1F &#39;: Abbildung2G). </li></ol></li></ol> 3. Montage Embryonen Fluid Flow in KV Analysieren <ol><li> Um asymmetrische Strömung in KV der globalen MO analysieren, MO oder Eigelb-gezielte MO injizierten Embryonen DFC-gezielte, sorgfältig dechorionate ~ 20 Embryonen zwischen 4-6 Somiten Stufen (~ 11-12 hpf) mit scharfen Pinzette. </li><li> Planen 50 ml 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und Aliquot in 5 ml Röhrchen als Flüssigkeit in einem trockenen Bad bei 42 ° C gehalten werden </li><li> Übertragen eines Embryos zu einem Glas Depressionen slide (United Scientific Supplies, Inc.) und entfernen Sie so viel wie möglich am Wasser. Immobilisierung des Embryos, indem genügend warme 1% niedrig schmelzende Agarose gerade bedeckt den Embryo (zu viel Agarose mit anschließender Bildgebung stören). Wie die Agarose erstarrt, verwenden Pinzette, um den Embryo einer solchen Position, dass KV nach oben (dorsal) (Abbildung 1H). Montieren 10 Embryonen mit einem Embryo pro Folie. Arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass alle Injektionen in den nächsten Schritt komplETED vom 10 Somiten-Stadium (14 hpf). </li></ol> 4. Die Injektion von Fluorescent Microbeads in KV <ol><li> Verdünnte Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 Mikron Durchmesser Mikrokugeln (Polysciences, Inc.) bis 1:50 in sterilem Wasser in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Mischen Sie die 1:50-Verdünnung von Mikroperlen gründlich durch Antippen des Röhrchens und laden 3 ul in eine Kapillare Nadel. Mit der gleichen Mikroinjektor für MO-Injektionen (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor) verwendet, brechen die Nadelspitze mit einer Pinzette und passen Sie die Injektion Einstellungen, um die kleinstmögliche (&lt;0,5 nl) Injektion Tropfen zu erzeugen. </li><li> Unter einem Binokular, richten Sie die Nadel mit der KV Lumen der ersten montiert Embryo. Führen Sie die Nadel in das Lumen und injizieren ein kleines Volumen (&lt;0,5 nl) von Perlen (1G). Eine kleine Nadelspitze und kleinen Injektionsvolumen sind entscheidend, um eine Beschädigung KV vermeiden. </li><li> Inject alle gemounteten Embryonen. Sobald ein Embryo war injected, ein Tropfen von sterilem Wasser kann auf der Oberseite der Agarose gegeben werden, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Im Verlauf der Injektionen, werden die Kügelchen oft behindern die Nadelöffnung. Das erfordert ein Brechen der Nadelspitze und Einstellen der Einspritzvolumen durch Modulieren des Drucks oder Zeiteinstellung des Mikroinjektionsvorrichtung. Ersetzen Sie die Nadel, wenn es stumpf genug, um erhebliche Schäden während der Injektion verursacht wird. </li><li> Bildschirm die injizierten Embryonen für die erfolgreiche Durchführung der Perlen unter einer aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop (zB Zeiss AxioImager M1) mit einem 20x-Objektiv. Erstens, festzustellen, ob KV intakt mit Hellfeldbeleuchtung (Abbildung 1J) ist, und verwenden Sie dann Fluoreszenz, um die Perlen zu beobachten. Wählen Embryonen, in denen Perlen vorhanden sind und sich innerhalb des KV Lumen. Verwerfen von Embryonen mit KV Schäden oder ohne schwimmende Perlen in KV. Es ist leicht zu KV verpassen und liefern Perlen umliegendes Gewebe oder der zugrunde liegenden Eigelb. Wenn erfolglos, mount anoweitere 10 Embryonen und wiederholen Sie die Injektion. </li></ol> 5. Visualisierung und Analyse von KV Strömungstechnik <ol><li> Für jeden ausgewählten Embryos mit Perlen im Inneren KV, einen Tropfen von sterilem Wasser, um die Agarose zu decken und dann beobachten, KV unter dem aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop unter Verwendung eines 63X Wasser Eintauchen Ziel (Abbildung 1I). Alternativ kann ein Deckglas für die Verwendung mit Wasser nicht Eintauchen Ziele und / oder inverse Mikroskope aufgebracht werden. </li><li> Verwenden Sie ein High-Speed-Kamera auf dem Mikroskop montiert (z. B. Zeiss AxioCamHSm), um eine 10 sec Film aufzuzeichnen. Notieren Sie sowohl die Perlen mit dem fluoreszierenden Kanal (ca. 70 Bilder / s) und die KV Lumen mit einer Hellfeld-oder Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Kanal. </li><li> Um alle bead Bewegungen im Laufe der Zeit zu visualisieren, importieren Sie den Film von fluoreszierenden Kügelchen in ImageJ-Software (kostenloser Download unter <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) einend eine maximale Projektion aller Fluoreszenzsignale im Film. Um die maximale Projektion in ImageJ durchzuführen, klicken Sie auf &quot;Bild → Stacks → Z-Projekt.&quot; In der &quot;Z-Projekt&quot; Fenster Projekt Scheiben mit Projektionsfläche Art von &quot;Max Intensität&quot;. Dieses Bild kann auf einem Bild des DIC KV in denen die Perlen abgebildet (3A-B) wurden übereinandergelegt werden. </li><li> Die Bewegungen der einzelnen Perlen, können sie mithilfe ImageJ werden. Ein Plugin (&quot;Manual Tracking&quot;) kann heruntergeladen werden unter <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . Öffnen Sie das fluoreszierende Kügelchen Film in ImageJ und führen Sie das manuelle Tracking-Funktion. In dem Fenster der manuellen Tracking, zu überprüfen &quot;show parameters&quot; und Eingabeparameter für &quot;Zeitintervalle&quot; und &quot;x / y-Kalibrierung&quot;. Manuell auswählen Perlen, die in der Brennebene des Films für ≥ 50 Frames bleiben und dann zu verfolgen ≥ 5 Perlen pro Embryo. Der Weg und die Geschwindigkeit eines jeden Wulstes durch th erzeugtene Software (Abbildungen 3 CD). </li></ol>

<ol>
	<li>Sutherland, M. J., Ware, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+left-right+asymmetry:+heterotaxy+and+situsinversus.">Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus.</a> Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).</li><li>Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer's+vesicle+is+a+ciliated+organ+of+asymmetry+in+the+zebrafish+embryo+that+initiates+left-right+development+of+the+brain,+heart+and+gut.">Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut.</a> Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+KIF3B+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Essner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+for+embryonic+nodal+cilia.">Conserved function for embryonic nodal cilia.</a> Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros,+brain+and+Kupffer's+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis.">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).</li><li>Schweickert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+leftward+flow+determines+laterality+in+Xenopus.">Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus.</a> Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).</li><li>Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+to+left-right+asymmetry.">The key to left-right asymmetry.</a> Cell. 127 (1), 27-32 (2006).</li><li>Cooper, M. S., D'Amico, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+noninvolutingendocytic+cells+at+the+margin+of+the+zebrafish+blastoderm+marks+the+site+of+embryonic+shield+formation.">A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation.</a> Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).</li><li>Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fates+at+the+dorsal+margin+of+the+zebrafish+gastrula.">Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula.</a> Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).</li><li>Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+T-box+genes+play+independent+and+cooperative+roles+to+regulate+morphogenesis+of+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).</li><li>Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+shaping+of+the+laterality+organ+in+zebrafish.">Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish.</a> Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).</li><li>Amack, J. D., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+box+transcription+factor+no+tail+in+ciliated+cells+controls+zebrafish+left-right+asymmetry.">The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry.</a> Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Law, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+zebrafish+blastomeres.+I.+Cleavage+pattern+and+cytoplasmic+bridges+between+cells.">Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells.</a> Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).</li><li>Arrington, C. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-embryonic+syndecan+2+regulates+organ+primordia+migration+and+fibrillogenesis+throughout+the+zebrafish+embryo.">Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo.</a> Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).</li><li>Caron, A., Xu, X., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+directly+regulates+Foxj1+expression+and+ciliogenesis+in+zebrafish+Kupffer's+vesicle.">Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle.</a> Development. 139 (3), 514-524 (2012).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+Rock2b+establishes+anteroposterior+asymmetry+of+the+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 45-54 (2011).</li><li>Aamar, E., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+chordin+are+required+for+formation+of+Kupffer's+vesicle+and+left-right+asymmetry+determination+in+zebrafish.">Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).</li><li>Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+during+embryo+development+regulates+cilia+length+in+diverse+epithelia.">FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia.</a> Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).</li><li>Schneider, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Nkd1+promotes+Dvl+degradation+and+is+required+for+left-right+patterning.">Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning.</a> Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).</li><li>Matsui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canopy1,+a+positive+feedback+regulator+of+FGF+signaling,+controls+progenitor+cell+clustering+during+Kupffer's+vesicle+organogenesis.">Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+alpha2+and+Ncx4a+regulate+zebrafish+left-right+patterning.">Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning.</a> Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).</li><li>Esguerra, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ttrap+is+an+essential+modulator+of+Smad3-dependent+Nodal+signaling+during+zebrafish+gastrulation+and+left-right+axis+determination.">Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination.</a> Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning.">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li><li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish.">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li><li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+in+zebrafish.">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit stage-spezifischen Injektionen MO dem DFC / KV Zelllinie Ziel ist ein nützlicher Ansatz zur Zell-Autonomie der Genfunktion zu studieren und zu vermeiden pleiotrope Phänotypen verursacht durch die globale Gen knockdown. Allerdings können diese Injektionen technisch anspruchsvoll. Injektion von MO zwischen den 256-Zelle und 1000-Zellen-Stufen können in drei möglichen Ergebnissen führen: 1) die MO bleibt aggregiert an der Injektionsstelle, 2) die MO diffundiert während des Eigelbs und tritt DFC / KV Zellen oder ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Standard Control Oligo-Lissamine getaggt </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Benutzerdefinierte Rock2b Morpholino Oligo </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 Mikron Microspheres </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

Inneren Organen wie Herz, Gehirn und Darm entwickeln Links-Rechts-(LR) Asymmetrien, die kritisch für ihre normale Funktion 1 sind. Motile Zilien sind bei der Festlegung LR Asymmetrie in Wirbeltierembryonen, einschließlich Maus, Frosch und Zebrafisch 2-6 beteiligt. Diese &quot;LR Zilien, Generate asymmetrischen Fluidströmung, die erforderlich sind, um eine konservierte asymmetrischen Nodal (TGF-β-Superfamilie) Signalkaskade in der linken Seitenplatte Mesoderm, die vermutlich LR Strukturieren Informationen zum Entwickeln Organen 7 bereitzustellen wird auslösen soll. Somit, um Mechanismen LR Strukturieren zu verstehen, ist es wichtig, Gene, die die Organisation des LR Flimmerzellen, die Motilität und die Länge von LR Zilien und ihrer Fähigkeit, stabile asymmetrische Strömung erzeugen regulieren identifizieren. In der Zebrafisch-Embryos werden LR Flimmerhärchen in Kupffer-Vesikel (KV) 2,4,5 entfernt. KV ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen umfaßt monociliateddass ein mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum umschließen. Schicksal Mapping hat gezeigt, dass KV aus einer Gruppe von ~ 20-30 Zellen als dorsalen Vorläuferzellen (DFCs), die an der dorsalen Rand Blastoderm wandern während epiboly Stufen 8,9 bekannt abgeleitet ist. Während der frühen Somiten Stufen, um DFCs Cluster und differenzieren sich in Flimmerepithelzellen KV in der Schwanzknospe des Embryos 10,11 bilden. Die Fähigkeit, zu identifizieren und zu verfolgen DFCs-in Kombination mit optischen Transparenz und rasche Entwicklung des Zebrafisch-Embryos-make Zebrafisch KV ein hervorragendes Modell System LR Flimmerzellen studieren. Interessanterweise behalten Vorläuferzellen des DFC / KV Zellstammbaums cytoplasmatischen Brücken zwischen dem Eigelb Zelle bis zu 4 Stunden nach der Befruchtung (HPF), während zytoplasmatische Brücken zwischen dem Eigelb Zelle und andere embryonalen Zellen schließen nach 2 hpf 8. Unter Ausnutzung dieser zytoplasmatischen Brücken, entwickelten wir ein Stadium-spezifische Injektion Strategie Morpholino Oligonucleotide liefernotides (MO) ausschließlich DFCs und Knockdown die Funktion eines gerichteten Gens in diesen Zellen 12. Diese Technik schafft chimären Embryos in dem Genfunktion in dem DFC / KV Linie entwickeln im Kontext eines Wildtyp-Embryos wird geklopft. Um asymmetrische Strömung in KV analysieren, injizieren wir fluoreszierenden Mikrokügelchen in den KV Lumen und aufzeichnen bead Bewegung mit Videomikroskopie 2. Fluidströmung einfach visualisiert und können durch die Verfolgung bead Verschiebung im Laufe der Zeit quantifiziert werden. Hier mit dem stufenspezifischen DFC-Zielgens Knockdown Technik und Injektion von fluoreszierenden Mikrokugeln in KV zu fließen visualisieren stellen wir ein Protokoll, das einen effektiven Ansatz, um die Rolle eines bestimmten Gens während KV Entwicklung und Funktion charakterisieren bereitstellt.

Stufenspezifischen MO Injektionen stellen einen nützlichen Ansatz Genfunktion in bestimmten Kompartimenten des Embryos zu analysieren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Injektion Strategien verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen und wie zu testen, um fluoreszierende Beads einzuführen, um den Fluidstrom zu visualisieren in KV. Die Verteilung der fluoreszierenden MO in erfolgreichen stufenspezifischen injizierten Embryonen ist schematisch in den 1D-F ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle at JoVE.com

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

Cilia-generated Fluidströmung in Kupffer-Vesikel (KV) steuert links-rechts Strukturierung des Zebrafisch-Embryos. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Modulation Genfunktion spezifisch in Zellen KV. Darüber hinaus zeigen wir, wie fluoreszierende Kügelchen in KV liefern Strömung zu visualisieren.

Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.7K Aufrufe.  Upstate Medical University. Cilia-generated Fluidströmung in Kupffer-Vesikel (KV) steuert links-rechts Strukturierung des Zebrafisch-Embryos. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Modulation Genfunktion spezifisch in Zellen KV. Darüber hinaus zeigen wir, wie fluoreszierende Kügelchen in KV liefern Strömung zu visualisieren.

Serie: Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Forschung

Biologie

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

Annotation of Plant Gene-Funktion über Kombinierte Genomics, Metabolomik und Informatik

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...