Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, wichtige Schlüsselaspekte der E3-Ligasefunktion zu analysieren, einschließlich E2-Enzymspezifität, Substratauswahl und Ubiquitintransfer. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre breite Anwendbarkeit, da Proteine aus allen eukaryotischen Quellen rekombinant exprimiert und in vitro untersucht werden können, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Bei der erstmaligen Anwendung der Lysin-Entladungstechnik ist es wichtig, Assay-Parameter wie Enzymkonzentrationen zu optimieren, um die idealen Austragsbedingungen für die E3-Ligase ihrer Wahl zu identifizieren.
Um einen In-vitro-Autoubiquitylierungsassaylat durchzuführen, richten Sie ein Pipettierschema ein, um die Funktionsfähigkeit verschiedener E2-Enzyme zu testen und eine Mastermischung auf Eis für alle Ubiquitylierungsreaktionen plus eine zusätzliche Reaktion vorzubereiten. Als nächstes fügen Sie ein Mikromolar von E2-Enzymen in die entsprechenden Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Proben in einem PCR-Thermocycler für zwei Stunden unter den angegebenen Bedingungen. Nach der Inkubation SDS-Probenpuffer zu jeder Reaktion hinzufügen und mehrmals durch Pipettieren mischen.
Dann kochen Sie die Proben sofort bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten und lagern Sie die denaturierten Proteine bei 20 Grad Celsius. Um einen In-vitro-Substrat-Ubiquitylierungstest durchzuführen, bereiten Sie das Pipettierschema für alle Reaktionen vor. Nachdem Sie die Menge an Master-Mix berechnet haben, die für eine Reaktion benötigt wird, bereiten Sie die Master-Mischung für alle Reaktionen auf Eis vor und fügen Sie die Master-Mischung zu jeder Tube hinzu.
Fügen Sie die jeweiligen E3-Ligasen einzeln hinzu. Anschließend werden die Proben wie demonstriert zwei Stunden lang im PCR-Thermocycler inkubiert. Am Ende der Inkubation zwei Mal SDS-Probenpuffer zu jeder Reaktion hinzufügen, mehrmals durch Pipettieren mischen und die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius kochen.
Um einen Lysin-Entladungsassay durchzuführen, richten Sie das Pipettierschema für die Ladereaktion ein und inkubieren Sie die Ladereaktionen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um die Ladereaktion zu stoppen, fügen Sie Apyrase in eine Endkonzentration von 1,8 Einheiten pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Reaktion fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation EDTA in eine Endkonzentration von 30 Millimol geben und das Volumen der Reaktion mit doppelt destilliertem Wasser auf 30 Mikroliter einstellen.
Um die E2-Ubiquitylierung durch E3 zu entladen, richten Sie fünf Röhrchen ein, die den Zeitpunkten für das Experiment entsprechen, fügen Sie jedem Röhrchen 6,7 Mikroliter nicht reduzierenden Probenpuffer hinzu, entfernen Sie sechs Mikroliter der gestoppten Ladereaktion aus dem Zeitpunkt-Null-Röhrchen und stellen Sie das Gesamtvolumen auf 26,7 Mikroliter ein. Um die Entladungsreaktionen einzurichten, fügen Sie zu jeder Reaktion doppelt destilliertes Wasser, Ubiquitylierungspuffer, BSA, Lysin, E3-Ligase und das geladene E2 hinzu. Nach den ausgewählten Zeiträumen werden 20-Mikroliter-Proben aus jeder Entladungsreaktion in das entsprechende Probenröhrchen überführt.
Dann wirbeln Sie die Proben sofort und legen Sie sie für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius auf. In dieser repräsentativen Western-Blot-Analyse war der inaktive CHIP nicht auto-ubiquityliert. Die E3-unabhängigen Ubiquitin-Produkte wurden jedoch in Gegenwart von inaktivem CHIP und in Abwesenheit von CHIP gebildet.
Der Wildtyp-CHIP wurde in Kombination mit den Proteinen der UBE2D- und UBE2E-Familien auto-ubiquityliert, während die freien Polyubiquitin-Ketten in Zusammenarbeit mit den Proteinen der UBE2D-Familie, aber nicht mit den Proteinen der UBE2E-Familie hergestellt wurden. Die Bindung des Ubiquitins durch UBE2N/V1 steuerte die Bildung freier Ubiquitinketten. Die Autoubiquitylierung und Ubiquitylierung von UNC-45B wurde mit Wildtyp-CHIP, aber nicht mit der inaktiven Mutante von CHIP beobachtet, was darauf hindeutet, dass UNC-45B als konserviertes Substrat für CHIP fungiert.
Wenn die katalytische Aktivität von CHIP mit einem Lysin-Entladungsassay analysiert wurde, hatte das ungeladene UBE2D2-Enzym ein Molekulargewicht von 17 Kilodalton und das geladene UBE2D2 mit einem einzelnen Ubiquitinmolekül ein Molekulargewicht von etwa 26 Kilodalton. Zum Zeitpunkt 0 wurde die gesamte geladene E2-Ausbeute beobachtet. In Gegenwart von inaktivem CHIP wurde eine schwache E3-ligaseunabhängige Entladung von UBE2D2, aber keine Autoubiquitylierung von CHIP nachgewiesen.
In Gegenwart von Wildtyp-CHIP war die Entladung von UBE2D2 schnell und innerhalb von 60 Minuten abgeschlossen, und die Autoubiquitylierung von CHIP zeigte einen Transfer von Ubiquitin auf seine eigenen Lysinreste an. Aufgrund der begrenzten E2-Fähigkeit arbeiten Sie so schnell wie möglich und fahren Sie sofort mit der Entladungsreaktion fort, gefolgt von SDS-PAGE und Western Blotting. Nach diesen In-vitro-Ubiquitylierungsprotokollen können die spezifischen Typen der Ubiquitylierung identifiziert werden, indem die Western Blots mit verknüpfungsspezifischen Antikörpern untersucht werden.
