Wir danken Aida de la Cruz für die Entwicklung und Vermittlung der Original-Protokoll, auf dem diese Version 10 basiert. Die Arbeit in der Buttitta Lab wird von NIH GM086517 unterstützt.

1. Fly Tierhaltung <ol><li> Kreuz fliegt der gewünschten Genotypen in schmalen Plastikröhrchen mit 10 ml Hefe-Glucose Medium 3 oder anderen eiweißreichen Medien Ihrer Wahl. Die umfangreichen Drosophila transgenen Tools für gewebespezifische Expression und Abstammung Tracing mit in vivo Fluoreszenz-Protein-Expression sind an anderer Stelle ausführlich beschrieben 4,5. Übertragen Eltern an die frische Fläschchen täglich Serie von 24 hr Nachkommen Sammlungen zu erhalten, oder für genauere Inszenierung, sammeln Embryonen auf Agar-Platten übertragen und frisch geschlüpfte Larve Fläschchen wie beschrieben 10. Um einheitliche Bedingungen für Experimente zu gewährleisten und vermeiden Überbelegung, sollte die Gesamtzahl der F1-Nachkommen in einem einzigen Fläschchen nicht mehr als 100 sein. Je nach dem genetischen Aufbau des Experiments halten Fläschchen in einem geeigneten Inkubator bis die gewünschte Entwicklungsstadium. </li><li> Sammle Versuchstiere: Sie reifen Larven im 3. Larvenstadium müssenLarvenstadium (L3) bei etwa 110-120 Stunden der Entwicklung für Larven Dissektionen oder weiß Vorpuppe (WPP) für eine genaue pupal Inszenierung. Dramatische Zellzyklus Änderungen, einschließlich eines Schalters zu einem nicht-proliferativen Zustand treten an verschiedenen Zeitpunkten während der Metamorphose 12,13. Daher richtige Inszenierung Puppe (innerhalb 1 Stunde der Entwicklung) ist wichtig für reproduzierbare Zellzyklus Daten während der Metamorphose. WKA entspricht 0 h nach der Bildung Puppe (0 h APF), wie in 1 gezeigt,-I. Sammeln WPP in einer 35 mm Petrischale auf einem gefalteten Kimwipe nass mit 2,5 ml Wasser, etwas Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Alter Puppe, bis die gewünschte Stufe (Stunden APF) bei entsprechender Temperatur. Beachten Sie, dass das 1,2-fache schneller Entwicklung bei 29 ° C abläuft und 2,2 mal langsamer bei 18 ° C als bei der Standard-25 ° C 14. </li><li> Hitze-Schock-Tiere Hitzeschock-flipase (hs-FLP)-induzierte Rekombination zur Abstammungslinie-Tracing-Klone bei Bedarf 9,11 aktivieren. Für die Wärme-Schock der Larve, tauchenRöhrchen in ein Wasserbad (eingestellt auf 37 ° C) und ermöglicht Larven vollständig untergetaucht. Für die Wärme-Schock der Puppe, Siegel der Petrischale mit Parafilm und voll eintauchen in das Wasserbad. Achten Sie darauf, Parafilm nach der Hitze-Schock zu entfernen, um genügend Sauerstoff Austausch für das Überleben der Tiere zu ermöglichen. Dauer des Hitzeschock-je nach Leistung des flipase Transgen verwendet und die Anzahl der Klone Wunsch. Wir verwenden routinemäßig 7-8 min zur Induktion &quot;flipout&quot; Linie Tracing Klone 15 in Larven mit dem hs-FLP Transgen auf dem ersten Chromosom und 2-4 min für Hitzeschock von Puppen in 35 mm Gerichte, während der hs-FLP Transgens auf das zweite Chromosom erfordert eine 20 min. Hitzeschock ähnliche Zahlen der Klone zu erhalten. </li></ol> Die Rate der Zellteilung und der Zeitpunkt der Präparation bestimmt Klongröße in jedem Gewebe. Unter normalen Bedingungen, so finden wir, dass die Klone in der Larven-Flügel mit einem 20 min Hitzeschock (mit dem hs-FLP Transgen auf dem zweiten Chromosom) und induziert dissected 48 Stunden später, enthalten etwa 20-30 gut getrennt Klone mit Größen von 10 Zellen pro Klon zu zwei Zellen pro Klon, mit einem Durchschnitt rund vier Zellen pro Klon. Im Gegensatz dazu seziert ein 7 min Hitze-Schock mit der gleichen hs-FLP Transgen Puppen in einer Petrischale bei 0 hr APF 36 Stunden später, Renditen gut getrennt Klone (ca. 15-25) von einem bis zu vier Zellen mit einer durchschnittlichen von 2,2 Zellen pro Klon. Diese Daten können verwendet werden, um die durchschnittliche Zellverdopplungszeit für das Gewebe in Untersuchung zu bestimmen. 2. Dissection <ol><li> Sanft übertragen die Larven / Puppen auf ein Klarglas Dissektion Schale mit 1X PBS. </li><li> Mit einem Binokular und viel Licht, sanft erfassen eine Larve durch den Bauch mit einem scharfen Inox # 5 forcep, schneiden Sie die vordere Drittel mit Mikro-Schere, und invertieren die vorderen Drittel, indem Sie die Mund-Bereich nach innen in Richtung der hinteren, während die Larven Nagelhaut konstant (Abbildung 1A). Entfernen Sie vorsichtig opaque fetten Körper und der verbleibende Darm, um die Sichtbarkeit der gewünschten Geweben, wie Flügel, Augen oder Gehirn zu erhöhen. Präparieren Sie die gewünschten Gewebe; sauber entfernen Flügel von Luftröhre und Nagelhaut mit einer Pinzette, die Augen von Mund-Haken, oder das Gehirn von den Augen (1G). </li><li> Für Sezieren Puppe, verwenden Sie einen forcep sanft erfassen eine Puppe von der vorderen Spitze des pupal Fall, wo es eine Luftblase, um eine Beschädigung der Puppe innen (Abbildung 1C). Zange oder Mikro-Schere in der gegnerischen Hand kann verwendet werden, um die Position schwimmende Puppe für die richtige Greifen werden. Sauber durch die hintere Spitze der Puppe mit Mikro-Schere geschnitten. Dieser Querschnitt Schnitt sollte in einem leichten Winkel in Richtung der dorsalen Teil des Tieres getroffen werden, um den inneren Druck, ohne dass der histolyzed Fett in die gewünschten Gewebe in der Brust und den Kopf frei. Schneiden Sie vorsichtig entlang der dorsalen Median, die Vermeidung der Flügel und das vordere Auge-Gehirn-Komplex. Entfernen Sie vorsichtig die Puppe aus der PuppenFall durch das Greifen der hinteren Kante des pupal Epidermis und Herausziehen des Puppenhülle (1D). Stoßen Sie ein kleines Loch in der Kutikula anterior der Auge-Gehirn-Komplex mit einer Pinzette. Mit einem Glas Pasteurpipette mit einem Gummiball, vorsichtig waschen PBS Dissektion Lösung durch die teilweise zerlegt Puppe zu histolyzed Fett und alle verbleibenden Darmgewebe zu entfernen. Diese auch wirksam zur Schmierung der Glaspipette mit Lipiden und Proteinen, die das Auftreten von Gewebe seziert reduziert Kleben an der Einrichtung der Glaspipette später. </li><li> Um pupal Flügel erhalten, Kuvertierung die Kutikula der Flügel und die Flügel selbst muss aus der Puppe (1E) aufgebrochen werden. Dies kann durch Halten der Puppe, die von der Kopf mit einer Zange, während mit einem anderen forcep entweder greifen die meisten hinteren Spitze des Flügels Kutikula und Herausziehen oder Rangieren des forcep unter dem Flügel der Nähe des Scharniers vor verdrängen es von der Seite erfolgen die Karkasse (Fild 1E). Die Flügel können dann geschnitten oder gerissen am Scharnier, um es von dem Körper zu entfernen und in einem Stapel von den Tierkörpern und anderen Materialien. </li><li> Um pupal Augen oder Gehirn zu erhalten, waschen Sie die Puppe bis zum Auge-Gehirn-Komplex verdrängt wird und frei von der Puppe (1F, 1H). Mit einer Zange, ziehen Sie den pupal Auge vom Gehirn und speichern Sie das gewünschte Gewebe. </li><li> Nicht länger als 45 Minuten, um jede Probe sezieren, wie Ergebnisse wird weniger genau, je länger die Zellen in PBS nach dem Öffnen die Tiere verlassen. </li></ol> 3. Gewebedissoziation und DNA-Färbung <ol><li> Mit einem geschmierten Pasteur Pipette vorsichtig seziert die Gewebe in 0,5 ml der Live-DNA Stain-Lösung in einem 5 ml Polystyrol Rohr (1G). Transfer so wenig wie möglich PBS (weniger als 300 ul) in die DNA Stain Solution wird als Verdünnung von Trypsin hemmen Gewebedissoziation. </li><li> Die Röhrchen mit shaking bei 23 ° C bei 500 rpm (wir verwenden einen Eppendorf Thermomixer). </li><li> Inkubieren für 70 min, dann vortexen für 5 sec bei einer mittleren Geschwindigkeit (Einstellung 5). Übermäßige Verwirbelung bewirkt Zellaufschluss und Form Schutt, während unter-Vortex zu Zellklumpen führen wird. Bringen Sie die Proben Schütteln bei 23 ° C bei 500 rpm für weitere 15 bis 20 Minuten vor dem Vortexen sie noch einmal für 5 Sekunden bei einer Geschwindigkeit 5. </li><li> Für Gehirn und Augen pupal älter als 36hAPF wird ein modifiziertes Protokoll erforderlich. Dissociate Gewebe in DNA Stain-Lösung bei 23 ° C bei 500 rpm für 45-60 min in 1,7 ml Reaktionsgefäße. Dann one-by-one manuell distanzieren große Teile des Gewebes durch die Übertragung zu sezieren Gericht zusammen mit etwa 50 ul DNA Stain Solution und schnellen Auf-und Abpipettieren mit einer manuell gezeichnet Pasteurpipette 16 (von etwa 100-150 um Öffnung). Übertragen Sie jede dissoziierten Probe mit dem Rest der 0,5 ml DNA Stain-Lösung in ein 5-ml-Tube. Inkubieren eine zusätzliche 45-30 Min (bis zu 90 min der gesamten Inkubationszeit) bei 23 ° C unter Schütteln bei 500 rpm bis Klumpen sind nicht mehr sichtbar. </li><li> Völlig losgelöst Proben sollten nur sehr wenige große Brocken von Gewebe sichtbar, obwohl beachten Sie, dass die acellular transparent pupal Flügel Nagelhaut nicht distanzieren wird. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Schalten Sie den Attune cytometer und öffnen Sie die Attune Software. Die cytometer Laser sollte über das Start-Menü eingeschaltet werden, und eine tägliche Performance-Test sollte mit Performance-Tracking Beads mit ausreichender Partituren vor jedem Tag der Datenerfassung durchgeführt werden. Flüssigkeitsstände sollte mindestens halb voll und Abfall vor dem Leistungstest entleert. Details zum Start, die ordnungsgemäße Kalibrierung und Betrieb des Attune können im Attune Handbuch (gefunden werden <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ) </li><li> Entwerfen Sie ein neues template indem 4 Dot-Plots und 2 Histogramme in einem leeren Arbeitsbereich mit den angegebenen Parametern in 4.3, oder wählen Sie eine bereits gestaltete Vorlage für das Experiment geeigneten und geben die Anzahl der Proben gesammelt werden. Wir haben Attune Vorlagen (Dateien in. Bekommen Format) für Live-Drosophila Zellzyklusanalyse versehen mit Vybrant DyeCycle Violet und GFP oder RFP Expression in Anhang I. </li><li> Die Vorlagen bereitgestellt werden, umfassen vier Punktplots und zwei Histogramme mit den Parametern in Abbildung 2 angegeben. Kanäle zur Erfassung gehören: FSC und SSC - Vorwärtsstreulicht und Seitwärtsstreuung anzeigt Zellgröße und Membran Komplexität VL1 Höhe (H), Breite (B) und die Fläche (A) - was Violet Laser-Anregung von DyeCycle Violet Färbung der DNA, und BL1 -A - Blau Laser Kanal 1 Area, der angibt, GFP-Fluoreszenz. Die mitgelieferte Schablone für RFP-Analyse ist identisch mit der Vorlage für die GFP-Analyse, außer dass es die Blaue Laser Kanal 3 (BL3-A), die Optimierung ist verwendetzed für RFP-Erkennung. </li><li> Die Dot-Plots in den Templates haben Tore zu Analyse, um den gewünschten Populationen zu beschränken und Schutt und Zellklumpen aus der Analyse (Abbildung 2) zu begrenzen. Gate 1 schließt Schmutz und Klumpen auf SSC gegen FSC (2A) basiert. Gate 2 schließt ungefärbte Zellen, sub G1 apoptotischen Zellen und Zellklumpen nach der Identifizierung von Singuletts (VL1Area vs VL1Width) (2B) basiert. Gate 3 ist eine abgeleitete Tor, umfassend Zellen innerhalb Toren 1 und 2, und identifiziert GFP (oder RFP) negative Zellen gegen DNA-Gehalt auf VL1Height (Abbildung 2C) basiert. Gate 4 ist eine abgeleitete Tor, umfassend Zellen innerhalb Toren 1 und 2, und identifiziert GFP (oder RFP) positive Zellen gegen DNA-Gehalt (Abbildung 2C). Dot Plots der Größe der einzelnen Zellen durch GFP (oder RFP) vs forward scatter (FSC) gemessen werden verwendet, um Tore 5 und 6 (2D) zu erzeugen. Die beiden Histogramme Grundstück DNA-Gehalt auf der X-Achse und Zellzahl auf dem Y-axis für die Bevölkerung durch Tor 3 und Tor 4 definiert. (2E und 2F) Histogramme können auch für Zellgröße einbezogen werden, wenn gewünscht wird (nicht dargestellt). Für Zellgröße Histogramme sollte Populationen Gatter 5 und 6 eingestellt werden, Plotten FSC auf der X-Achse und setzt auf die y-Achse. </li><li> Set Aufnahme bei 10.000 GFP oder RFP positive Ereignisse (dies wird Gate 4, das abgeleitete Gate of Gate 1, Tor 2 und der GFP oder RFP positive Gate sein) zu stoppen. Messbereiche von 6.000 - 10.000 GFP positive Ereignisse haben traditionell das Ziel für die Veröffentlichung Qualitätsprofile 9,11. Wir schlagen vor, mit einem Minimum von 15 Flügel oder Augen, dass ca. 50% GFP positiv sind, um eine ausreichende Gate 4 Veranstaltungen 10 für hochwertige Profile erhalten. Allerdings haben wir erfolgreich klare Daten nur für vorläufige Zellzyklusanalyse aus nur 6 Flügel (3A) erhalten. Stellen Sie die Lautstärke für Erwerb 300 ul, wird dies etwa 460 ul der insgesamt 0,5 ml Probe zu verwenden. Tabelle 2 zeigt die entsprechenden Schwellen-und Spannungs-Einstellungen in der Vorlage für das Beispiel in Abbildung 2 vorgesehen. </li><li> Führen Proben bei Standard-Empfindlichkeit oder hohe Empfindlichkeit 100 ul / min und aufzeichnen. Wir finden wenig bis gar keinen Unterschied in unsere Analyse mit den verschiedenen Empfindlichkeitsstufen. Durch die akustische Fokussierung der Zellen, kann dies cytometer genau messen Proben bei sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Zytometern, finden wir keinen Kompromiss Daten durch den Erwerb einer Geschwindigkeit von bis zu 1.500 Ereignisse pro Sekunde. Die aufgezeichneten Daten Dateien von der Software generiert Attune sind. FCS-Format, das kompatibel mit den meisten Zellzyklus-Modellierungs-Software ist. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Histogramme von Zellgröße und DNA-Gehalt für GFP (oder RFP) positive und negative Population verglichen werden kann. Sie können manuell durch Kopieren und Einfügen mit Hilfe von Adobe Photoshop-Software geschichtet werden. Wenn die y-Achse auf automatisch gesetzt ist, wird der Y-Achse mit der h skalierenighest Zählung für jede Probe. Überlagern von zwei Graphen mit der Y-Achse eingestellt, um autoscale erzeugt eine Überlagerung der Histogramme mit den Achsen für das globale Maximum für jede Population eingestellt. Dies ermöglicht eine einfache visuelle Vergleich der relativen Veränderungen in Zellzyklus Ausstieg, auch wenn insgesamt Zellzahlen von GFP positiven und negativen GFP Populationen nicht gleichwertig sind (Beispiel in Abbildung 3B). Alternativ kann eine individuelle y-Achse (y-Achse manuell Option) auf einen festen Wert für den Histogrammen eingestellt werden. In diesem Fall werden die relativen Zellzahlen zwei Populationen verglichen werden können. Da die Attune verwendet ein definiertes Volumen der Probe pro Lauf, absolute Quantifizierung von Zellen für jeden Lauf, in jedem Tor mit Prozentsätzen der gesamten Bevölkerung, aus der Statistik-Tabelle automatisch generiert während der Fahrt in den Arbeitsbereich (zB in 3F erhalten ). Dot Plots und Histogramme können auch einfach in der Software Attune geschichtet werden, durch einfaches Drag &amp; Drop verschiedene Proben von the Probe Datei-Menü auf der rechten Seite auf den gewünschten Graphen einer offenen Probe zum Vergleich. Doch um Subpopulationen aus einer einzigen Probe (dh GFP positiven und negativen GFP innerhalb der gleichen Probe) überlagern, verwenden wir Photoshop. </li><li> Zwei Methoden können zur relativen Prozentsätze der verschiedenen Phasen des Zellzyklus für eine Bevölkerung zu finden. Die Annäherung Verfahren beruht auf Benutzer definierte Bereiche, Grenzen der G1, S, G2 und&gt; G2 Gipfel abzugrenzen. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle und einfache Schätzungen der Werte innerhalb der benutzerdefinierten Regionen (3E). Wir setzen unseren Regionen basierend auf einer direkten Test mit Drosophila Kc Zellen, zum S-Phase markiert mit Ethynyl-desoxyuridin (EdU) Einarbeitung. Das zweite Verfahren verwendet Dritten Modellierungs-Software für die Abschätzung der Zellzyklus-Verteilung. Wir verwendeten ModFitLT (Verity Software House)-Software zum Beispiel in 3F. </li></ol>

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila.">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6 (2004).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li><li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi.">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li><li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells.">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li><li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Protokoll erlaubt die Analyse von Zellzyklus, bezogen Zellgröße und relative Zellzahl in Live Drosophila Gewebe bei verschiedenen Entwicklungsstadien. Wenn bei dieser Analyse Zelltyp-spezifische fluoreszierende Protein-Expression oder Linie Tracing gekoppelt ist, können detaillierte Informationen über die zellulären Reaktionen auf diskrete Zellzyklus oder Störungen Wachstum erhalten werden. Als proof of principle, gestört wir Ruhe im Puppenstadium fly Gehirn durch Expression G1-S Ze...

Durchflusszytometrie können für Messungen der Lebensfähigkeit der Zellen, bezogen Zellgröße, DNA-Gehalt und fluoreszierende Protein-Expression in lebenden Zellpopulationen verwendet werden. Durch die Replikation von Kern-DNA während der S-Phase, über DNA-Gehalt in einer Population von Zellen, die den relativen Prozentsätze der verschiedenen Phasen des Zellzyklus 1-3 abzuleiten. Diese Methode hat sich zu einem Eckpfeiler der Zellzyklus-Analyse in Modellsystemen von Hefe bis zu den Säugetieren. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat sich ein hervorragendes Modell für genetische Analysen in vivo Regulation des Zellzyklus. Die umfangreiche genetische Werkzeuge zur Verfügung, in den Fliegen ermöglichen elegant gewebespezifische und zeitlich geregelt Manipulationen Zellzyklusregulatoren zusammen mit in vivo Fluoreszenz-Protein-basierten Linie Tracing 4-6. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um DNA-Gehalt in einer Reihe von Drosophila Zelltypen zu untersuchen, einschließlich endoreplicating Zellen und kultivierten Mitosezellen 7,8. Ein wichtiger Fortschritt in vivo Zellzyklusstudien wurde von de la Cruz und Edgar, mit der Entwicklung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse lebender diploiden Drosophila Imaginalscheiben 9,10, ein Protokoll, das verwendet wurde, und von vielen Labors geeignet. Diese Technik, wenn sie mit in vivo genetische Abstammung gekoppelt Tracing über induzierbare fluoreszierende Protein Expression und Gewebe spezifische Etikettierung, ermöglicht es, Informationen über Genmanipulation Auswirkungen auf die allgemeine Zellverdopplungszeit, Zellgröße zu erhalten und präzises Timing von Zellzyklus-Phasen bestimmen in vivo 9 , 11. Allerdings ist diese Methode bisher auf die Verwendung der Zellen durchlässig Hoechst 33342 DNA-interkalierenden Farbstoffs zu färben und zu quantifizieren, DNA in lebenden Zellen, die begrenzt Benutzer Zytometer mit einem UV-Laser, der Anregung der Hoechst Farbstoff fließen gestützt hat. Diese werden in der Regel nur in Sorter (dh BD FACS Vanta gefundenge, BD FACSAria) oder teure multicolor benchtop Systemen (zB BD LSR), in der Regel erfordern die Unterstützung durch institutionelle Flow Core Facilities. Wir haben die Hoechst-basiertes Protokoll modifiziert, um eine neue Live-Zell-DNA-Farbstoff von Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet verwenden. Dieser Farbstoff ist kompatibel mit einem violetten 405 nm Laser, häufiger in kleineren Tisch-Analysatoren und in der kleinen Selbstversorger-Tisch-Analysator, der Attune Acoustic Fokussierung Cytometer. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Protokoll für Zellzyklus-Analyse, mit Zelltyp Zellgröße, Zahl und Abstammung Analyse in einer Vielzahl von Geweben Drosophila während der verschiedenen Phasen der Entwicklung mit DyeCycle Violet und die Attune gekoppelt werden kann. Dieses Protokoll erweitert die Anzahl der Zytometern geeignet für eine solche Analyse mit Drosophila Gewebe und gibt Beispiele, wie diese Art von Live-Zellzyklus-Analyse kann für weitere Gewebetypen und Entwicklungsstadien geändert werden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

Durchflusszytometrie wurde in großem Umfang verwendet, um Informationen über DNA-Gehalt in einer Population von Zellen zu erhalten, um die relative Prozentsätze in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu schließen. Diese Technik wurde erfolgreich in den mitotischen Gewebe des Modellorganismus Drosophila melanogaster für genetische Studien von Zellzyklus-Regulation in vivo erweitert. Wenn mit Zelltyp-spezifische fluoreszierende Protein Expression und genetische Manipulationen gekoppelt, kann man detaillierte Informationen über Auswirkungen auf die Zellzahl, Zellgröße und Zellzyklus Phasing in vivo. Doch diese lebenden Zellen-Methode wurde für die Verwendung der Zellen durchlässig Hoechst 33342 DNA-interkalierenden Farbstoffes verlassen, Begrenzen Benutzer Durchflusszytometer mit einem UV-Laser ausgestattet. Wir haben dieses Protokoll geändert werden, um eine neuere lebenden Zellen DNA-Farbstoff, Vybrant DyeCycle Violet, kompatibel mit den häufigeren violett 405nm Laser verwenden. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht eine effiziente Zellzyklusanalyse mit Zelle gekoppeltTyps, der relativen Zellgröße und Zellzahl Informationen in einer Vielzahl von Drosophila Gewebe. Dieses Protokoll verlängert die Nutzungsdauer Zellzyklusanalyse Technik für Live Drosophila Gewebe auf einen kleinen Tisch-Analysator, der Attune akustischen Fokussiervorrichtung Zytometer, die ausgeführt werden und kann auf einem einzelnen-Labormaßstab gehalten werden.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse für ein Larven Flügel Probe, die GFP in der hinteren Hälfte des Gewebes mit dem mitgelieferten GFP-Vorlage. Ähnliche Ergebnisse werden mit der gleichen Gewebetyp und Expressionsmuster für RFP RFP mit dem mitgelieferten Schablone (3A) erhalten. Die zur Verfügung gestellten Vorlagen und Spannungen (Tabelle 2) sind geeignet für die Analyse von Larven Augen (3B), Gehirn und Flügel, sowie Puppen Augen, Gehirn (3D)<...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Ein Protokoll für die Zellzyklus-Analyse lebender<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer beschrieben. Dieses Protokoll liefert gleichzeitig Informationen über die relative Größe der Zellen, Zellzahl, DNA-Gehalt und Zelltyp über Linie Tracing oder gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen<em&gt; In vivo</em&gt;.

Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

live-cell-cycle-analysis-drosophila-tissues-using-attune-acoustic

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

13.5K Aufrufe.  University of Michigan. Ein Protokoll für die Zellzyklus-Analyse lebender Drosophila Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer beschrieben. Dieses Protokoll liefert gleichzeitig Informationen über die relative Größe der Zellen, Zellzahl, DNA-Gehalt und Zelltyp über Linie Tracing oder gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen In vivo.