Wir danken Aida de la Cruz für die Entwicklung und Vermittlung der Original-Protokoll, auf dem diese Version 10 basiert. Die Arbeit in der Buttitta Lab wird von NIH GM086517 unterstützt.

1. Fly Tierhaltung <ol><li> Kreuz fliegt der gewünschten Genotypen in schmalen Plastikröhrchen mit 10 ml Hefe-Glucose Medium 3 oder anderen eiweißreichen Medien Ihrer Wahl. Die umfangreichen Drosophila transgenen Tools für gewebespezifische Expression und Abstammung Tracing mit in vivo Fluoreszenz-Protein-Expression sind an anderer Stelle ausführlich beschrieben 4,5. Übertragen Eltern an die frische Fläschchen täglich Serie von 24 hr Nachkommen Sammlungen zu erhalten, oder für genauere Inszenierung, sammeln Embryonen auf Agar-Platten übertragen und frisch geschlüpfte Larve Fläschchen wie beschrieben 10. Um einheitliche Bedingungen für Experimente zu gewährleisten und vermeiden Überbelegung, sollte die Gesamtzahl der F1-Nachkommen in einem einzigen Fläschchen nicht mehr als 100 sein. Je nach dem genetischen Aufbau des Experiments halten Fläschchen in einem geeigneten Inkubator bis die gewünschte Entwicklungsstadium. </li><li> Sammle Versuchstiere: Sie reifen Larven im 3. Larvenstadium müssenLarvenstadium (L3) bei etwa 110-120 Stunden der Entwicklung für Larven Dissektionen oder weiß Vorpuppe (WPP) für eine genaue pupal Inszenierung. Dramatische Zellzyklus Änderungen, einschließlich eines Schalters zu einem nicht-proliferativen Zustand treten an verschiedenen Zeitpunkten während der Metamorphose 12,13. Daher richtige Inszenierung Puppe (innerhalb 1 Stunde der Entwicklung) ist wichtig für reproduzierbare Zellzyklus Daten während der Metamorphose. WKA entspricht 0 h nach der Bildung Puppe (0 h APF), wie in 1 gezeigt,-I. Sammeln WPP in einer 35 mm Petrischale auf einem gefalteten Kimwipe nass mit 2,5 ml Wasser, etwas Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Alter Puppe, bis die gewünschte Stufe (Stunden APF) bei entsprechender Temperatur. Beachten Sie, dass das 1,2-fache schneller Entwicklung bei 29 ° C abläuft und 2,2 mal langsamer bei 18 ° C als bei der Standard-25 ° C 14. </li><li> Hitze-Schock-Tiere Hitzeschock-flipase (hs-FLP)-induzierte Rekombination zur Abstammungslinie-Tracing-Klone bei Bedarf 9,11 aktivieren. Für die Wärme-Schock der Larve, tauchenRöhrchen in ein Wasserbad (eingestellt auf 37 ° C) und ermöglicht Larven vollständig untergetaucht. Für die Wärme-Schock der Puppe, Siegel der Petrischale mit Parafilm und voll eintauchen in das Wasserbad. Achten Sie darauf, Parafilm nach der Hitze-Schock zu entfernen, um genügend Sauerstoff Austausch für das Überleben der Tiere zu ermöglichen. Dauer des Hitzeschock-je nach Leistung des flipase Transgen verwendet und die Anzahl der Klone Wunsch. Wir verwenden routinemäßig 7-8 min zur Induktion &quot;flipout&quot; Linie Tracing Klone 15 in Larven mit dem hs-FLP Transgen auf dem ersten Chromosom und 2-4 min für Hitzeschock von Puppen in 35 mm Gerichte, während der hs-FLP Transgens auf das zweite Chromosom erfordert eine 20 min. Hitzeschock ähnliche Zahlen der Klone zu erhalten. </li></ol> Die Rate der Zellteilung und der Zeitpunkt der Präparation bestimmt Klongröße in jedem Gewebe. Unter normalen Bedingungen, so finden wir, dass die Klone in der Larven-Flügel mit einem 20 min Hitzeschock (mit dem hs-FLP Transgen auf dem zweiten Chromosom) und induziert dissected 48 Stunden später, enthalten etwa 20-30 gut getrennt Klone mit Größen von 10 Zellen pro Klon zu zwei Zellen pro Klon, mit einem Durchschnitt rund vier Zellen pro Klon. Im Gegensatz dazu seziert ein 7 min Hitze-Schock mit der gleichen hs-FLP Transgen Puppen in einer Petrischale bei 0 hr APF 36 Stunden später, Renditen gut getrennt Klone (ca. 15-25) von einem bis zu vier Zellen mit einer durchschnittlichen von 2,2 Zellen pro Klon. Diese Daten können verwendet werden, um die durchschnittliche Zellverdopplungszeit für das Gewebe in Untersuchung zu bestimmen. 2. Dissection <ol><li> Sanft übertragen die Larven / Puppen auf ein Klarglas Dissektion Schale mit 1X PBS. </li><li> Mit einem Binokular und viel Licht, sanft erfassen eine Larve durch den Bauch mit einem scharfen Inox # 5 forcep, schneiden Sie die vordere Drittel mit Mikro-Schere, und invertieren die vorderen Drittel, indem Sie die Mund-Bereich nach innen in Richtung der hinteren, während die Larven Nagelhaut konstant (Abbildung 1A). Entfernen Sie vorsichtig opaque fetten Körper und der verbleibende Darm, um die Sichtbarkeit der gewünschten Geweben, wie Flügel, Augen oder Gehirn zu erhöhen. Präparieren Sie die gewünschten Gewebe; sauber entfernen Flügel von Luftröhre und Nagelhaut mit einer Pinzette, die Augen von Mund-Haken, oder das Gehirn von den Augen (1G). </li><li> Für Sezieren Puppe, verwenden Sie einen forcep sanft erfassen eine Puppe von der vorderen Spitze des pupal Fall, wo es eine Luftblase, um eine Beschädigung der Puppe innen (Abbildung 1C). Zange oder Mikro-Schere in der gegnerischen Hand kann verwendet werden, um die Position schwimmende Puppe für die richtige Greifen werden. Sauber durch die hintere Spitze der Puppe mit Mikro-Schere geschnitten. Dieser Querschnitt Schnitt sollte in einem leichten Winkel in Richtung der dorsalen Teil des Tieres getroffen werden, um den inneren Druck, ohne dass der histolyzed Fett in die gewünschten Gewebe in der Brust und den Kopf frei. Schneiden Sie vorsichtig entlang der dorsalen Median, die Vermeidung der Flügel und das vordere Auge-Gehirn-Komplex. Entfernen Sie vorsichtig die Puppe aus der PuppenFall durch das Greifen der hinteren Kante des pupal Epidermis und Herausziehen des Puppenhülle (1D). Stoßen Sie ein kleines Loch in der Kutikula anterior der Auge-Gehirn-Komplex mit einer Pinzette. Mit einem Glas Pasteurpipette mit einem Gummiball, vorsichtig waschen PBS Dissektion Lösung durch die teilweise zerlegt Puppe zu histolyzed Fett und alle verbleibenden Darmgewebe zu entfernen. Diese auch wirksam zur Schmierung der Glaspipette mit Lipiden und Proteinen, die das Auftreten von Gewebe seziert reduziert Kleben an der Einrichtung der Glaspipette später. </li><li> Um pupal Flügel erhalten, Kuvertierung die Kutikula der Flügel und die Flügel selbst muss aus der Puppe (1E) aufgebrochen werden. Dies kann durch Halten der Puppe, die von der Kopf mit einer Zange, während mit einem anderen forcep entweder greifen die meisten hinteren Spitze des Flügels Kutikula und Herausziehen oder Rangieren des forcep unter dem Flügel der Nähe des Scharniers vor verdrängen es von der Seite erfolgen die Karkasse (Fild 1E). Die Flügel können dann geschnitten oder gerissen am Scharnier, um es von dem Körper zu entfernen und in einem Stapel von den Tierkörpern und anderen Materialien. </li><li> Um pupal Augen oder Gehirn zu erhalten, waschen Sie die Puppe bis zum Auge-Gehirn-Komplex verdrängt wird und frei von der Puppe (1F, 1H). Mit einer Zange, ziehen Sie den pupal Auge vom Gehirn und speichern Sie das gewünschte Gewebe. </li><li> Nicht länger als 45 Minuten, um jede Probe sezieren, wie Ergebnisse wird weniger genau, je länger die Zellen in PBS nach dem Öffnen die Tiere verlassen. </li></ol> 3. Gewebedissoziation und DNA-Färbung <ol><li> Mit einem geschmierten Pasteur Pipette vorsichtig seziert die Gewebe in 0,5 ml der Live-DNA Stain-Lösung in einem 5 ml Polystyrol Rohr (1G). Transfer so wenig wie möglich PBS (weniger als 300 ul) in die DNA Stain Solution wird als Verdünnung von Trypsin hemmen Gewebedissoziation. </li><li> Die Röhrchen mit shaking bei 23 ° C bei 500 rpm (wir verwenden einen Eppendorf Thermomixer). </li><li> Inkubieren für 70 min, dann vortexen für 5 sec bei einer mittleren Geschwindigkeit (Einstellung 5). Übermäßige Verwirbelung bewirkt Zellaufschluss und Form Schutt, während unter-Vortex zu Zellklumpen führen wird. Bringen Sie die Proben Schütteln bei 23 ° C bei 500 rpm für weitere 15 bis 20 Minuten vor dem Vortexen sie noch einmal für 5 Sekunden bei einer Geschwindigkeit 5. </li><li> Für Gehirn und Augen pupal älter als 36hAPF wird ein modifiziertes Protokoll erforderlich. Dissociate Gewebe in DNA Stain-Lösung bei 23 ° C bei 500 rpm für 45-60 min in 1,7 ml Reaktionsgefäße. Dann one-by-one manuell distanzieren große Teile des Gewebes durch die Übertragung zu sezieren Gericht zusammen mit etwa 50 ul DNA Stain Solution und schnellen Auf-und Abpipettieren mit einer manuell gezeichnet Pasteurpipette 16 (von etwa 100-150 um Öffnung). Übertragen Sie jede dissoziierten Probe mit dem Rest der 0,5 ml DNA Stain-Lösung in ein 5-ml-Tube. Inkubieren eine zusätzliche 45-30 Min (bis zu 90 min der gesamten Inkubationszeit) bei 23 ° C unter Schütteln bei 500 rpm bis Klumpen sind nicht mehr sichtbar. </li><li> Völlig losgelöst Proben sollten nur sehr wenige große Brocken von Gewebe sichtbar, obwohl beachten Sie, dass die acellular transparent pupal Flügel Nagelhaut nicht distanzieren wird. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Schalten Sie den Attune cytometer und öffnen Sie die Attune Software. Die cytometer Laser sollte über das Start-Menü eingeschaltet werden, und eine tägliche Performance-Test sollte mit Performance-Tracking Beads mit ausreichender Partituren vor jedem Tag der Datenerfassung durchgeführt werden. Flüssigkeitsstände sollte mindestens halb voll und Abfall vor dem Leistungstest entleert. Details zum Start, die ordnungsgemäße Kalibrierung und Betrieb des Attune können im Attune Handbuch (gefunden werden <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ) </li><li> Entwerfen Sie ein neues template indem 4 Dot-Plots und 2 Histogramme in einem leeren Arbeitsbereich mit den angegebenen Parametern in 4.3, oder wählen Sie eine bereits gestaltete Vorlage für das Experiment geeigneten und geben die Anzahl der Proben gesammelt werden. Wir haben Attune Vorlagen (Dateien in. Bekommen Format) für Live-Drosophila Zellzyklusanalyse versehen mit Vybrant DyeCycle Violet und GFP oder RFP Expression in Anhang I. </li><li> Die Vorlagen bereitgestellt werden, umfassen vier Punktplots und zwei Histogramme mit den Parametern in Abbildung 2 angegeben. Kanäle zur Erfassung gehören: FSC und SSC - Vorwärtsstreulicht und Seitwärtsstreuung anzeigt Zellgröße und Membran Komplexität VL1 Höhe (H), Breite (B) und die Fläche (A) - was Violet Laser-Anregung von DyeCycle Violet Färbung der DNA, und BL1 -A - Blau Laser Kanal 1 Area, der angibt, GFP-Fluoreszenz. Die mitgelieferte Schablone für RFP-Analyse ist identisch mit der Vorlage für die GFP-Analyse, außer dass es die Blaue Laser Kanal 3 (BL3-A), die Optimierung ist verwendetzed für RFP-Erkennung. </li><li> Die Dot-Plots in den Templates haben Tore zu Analyse, um den gewünschten Populationen zu beschränken und Schutt und Zellklumpen aus der Analyse (Abbildung 2) zu begrenzen. Gate 1 schließt Schmutz und Klumpen auf SSC gegen FSC (2A) basiert. Gate 2 schließt ungefärbte Zellen, sub G1 apoptotischen Zellen und Zellklumpen nach der Identifizierung von Singuletts (VL1Area vs VL1Width) (2B) basiert. Gate 3 ist eine abgeleitete Tor, umfassend Zellen innerhalb Toren 1 und 2, und identifiziert GFP (oder RFP) negative Zellen gegen DNA-Gehalt auf VL1Height (Abbildung 2C) basiert. Gate 4 ist eine abgeleitete Tor, umfassend Zellen innerhalb Toren 1 und 2, und identifiziert GFP (oder RFP) positive Zellen gegen DNA-Gehalt (Abbildung 2C). Dot Plots der Größe der einzelnen Zellen durch GFP (oder RFP) vs forward scatter (FSC) gemessen werden verwendet, um Tore 5 und 6 (2D) zu erzeugen. Die beiden Histogramme Grundstück DNA-Gehalt auf der X-Achse und Zellzahl auf dem Y-axis für die Bevölkerung durch Tor 3 und Tor 4 definiert. (2E und 2F) Histogramme können auch für Zellgröße einbezogen werden, wenn gewünscht wird (nicht dargestellt). Für Zellgröße Histogramme sollte Populationen Gatter 5 und 6 eingestellt werden, Plotten FSC auf der X-Achse und setzt auf die y-Achse. </li><li> Set Aufnahme bei 10.000 GFP oder RFP positive Ereignisse (dies wird Gate 4, das abgeleitete Gate of Gate 1, Tor 2 und der GFP oder RFP positive Gate sein) zu stoppen. Messbereiche von 6.000 - 10.000 GFP positive Ereignisse haben traditionell das Ziel für die Veröffentlichung Qualitätsprofile 9,11. Wir schlagen vor, mit einem Minimum von 15 Flügel oder Augen, dass ca. 50% GFP positiv sind, um eine ausreichende Gate 4 Veranstaltungen 10 für hochwertige Profile erhalten. Allerdings haben wir erfolgreich klare Daten nur für vorläufige Zellzyklusanalyse aus nur 6 Flügel (3A) erhalten. Stellen Sie die Lautstärke für Erwerb 300 ul, wird dies etwa 460 ul der insgesamt 0,5 ml Probe zu verwenden. Tabelle 2 zeigt die entsprechenden Schwellen-und Spannungs-Einstellungen in der Vorlage für das Beispiel in Abbildung 2 vorgesehen. </li><li> Führen Proben bei Standard-Empfindlichkeit oder hohe Empfindlichkeit 100 ul / min und aufzeichnen. Wir finden wenig bis gar keinen Unterschied in unsere Analyse mit den verschiedenen Empfindlichkeitsstufen. Durch die akustische Fokussierung der Zellen, kann dies cytometer genau messen Proben bei sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Zytometern, finden wir keinen Kompromiss Daten durch den Erwerb einer Geschwindigkeit von bis zu 1.500 Ereignisse pro Sekunde. Die aufgezeichneten Daten Dateien von der Software generiert Attune sind. FCS-Format, das kompatibel mit den meisten Zellzyklus-Modellierungs-Software ist. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Histogramme von Zellgröße und DNA-Gehalt für GFP (oder RFP) positive und negative Population verglichen werden kann. Sie können manuell durch Kopieren und Einfügen mit Hilfe von Adobe Photoshop-Software geschichtet werden. Wenn die y-Achse auf automatisch gesetzt ist, wird der Y-Achse mit der h skalierenighest Zählung für jede Probe. Überlagern von zwei Graphen mit der Y-Achse eingestellt, um autoscale erzeugt eine Überlagerung der Histogramme mit den Achsen für das globale Maximum für jede Population eingestellt. Dies ermöglicht eine einfache visuelle Vergleich der relativen Veränderungen in Zellzyklus Ausstieg, auch wenn insgesamt Zellzahlen von GFP positiven und negativen GFP Populationen nicht gleichwertig sind (Beispiel in Abbildung 3B). Alternativ kann eine individuelle y-Achse (y-Achse manuell Option) auf einen festen Wert für den Histogrammen eingestellt werden. In diesem Fall werden die relativen Zellzahlen zwei Populationen verglichen werden können. Da die Attune verwendet ein definiertes Volumen der Probe pro Lauf, absolute Quantifizierung von Zellen für jeden Lauf, in jedem Tor mit Prozentsätzen der gesamten Bevölkerung, aus der Statistik-Tabelle automatisch generiert während der Fahrt in den Arbeitsbereich (zB in 3F erhalten ). Dot Plots und Histogramme können auch einfach in der Software Attune geschichtet werden, durch einfaches Drag &amp; Drop verschiedene Proben von the Probe Datei-Menü auf der rechten Seite auf den gewünschten Graphen einer offenen Probe zum Vergleich. Doch um Subpopulationen aus einer einzigen Probe (dh GFP positiven und negativen GFP innerhalb der gleichen Probe) überlagern, verwenden wir Photoshop. </li><li> Zwei Methoden können zur relativen Prozentsätze der verschiedenen Phasen des Zellzyklus für eine Bevölkerung zu finden. Die Annäherung Verfahren beruht auf Benutzer definierte Bereiche, Grenzen der G1, S, G2 und&gt; G2 Gipfel abzugrenzen. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle und einfache Schätzungen der Werte innerhalb der benutzerdefinierten Regionen (3E). Wir setzen unseren Regionen basierend auf einer direkten Test mit Drosophila Kc Zellen, zum S-Phase markiert mit Ethynyl-desoxyuridin (EdU) Einarbeitung. Das zweite Verfahren verwendet Dritten Modellierungs-Software für die Abschätzung der Zellzyklus-Verteilung. Wir verwendeten ModFitLT (Verity Software House)-Software zum Beispiel in 3F. </li></ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. 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A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Protokoll erlaubt die Analyse von Zellzyklus, bezogen Zellgröße und relative Zellzahl in Live Drosophila Gewebe bei verschiedenen Entwicklungsstadien. Wenn bei dieser Analyse Zelltyp-spezifische fluoreszierende Protein-Expression oder Linie Tracing gekoppelt ist, können detaillierte Informationen über die zellulären Reaktionen auf diskrete Zellzyklus oder Störungen Wachstum erhalten werden. Als proof of principle, gestört wir Ruhe im Puppenstadium fly Gehirn durch Expression G1-S Ze...

Durchflusszytometrie können für Messungen der Lebensfähigkeit der Zellen, bezogen Zellgröße, DNA-Gehalt und fluoreszierende Protein-Expression in lebenden Zellpopulationen verwendet werden. Durch die Replikation von Kern-DNA während der S-Phase, über DNA-Gehalt in einer Population von Zellen, die den relativen Prozentsätze der verschiedenen Phasen des Zellzyklus 1-3 abzuleiten. Diese Methode hat sich zu einem Eckpfeiler der Zellzyklus-Analyse in Modellsystemen von Hefe bis zu den Säugetieren. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat sich ein hervorragendes Modell für genetische Analysen in vivo Regulation des Zellzyklus. Die umfangreiche genetische Werkzeuge zur Verfügung, in den Fliegen ermöglichen elegant gewebespezifische und zeitlich geregelt Manipulationen Zellzyklusregulatoren zusammen mit in vivo Fluoreszenz-Protein-basierten Linie Tracing 4-6. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um DNA-Gehalt in einer Reihe von Drosophila Zelltypen zu untersuchen, einschließlich endoreplicating Zellen und kultivierten Mitosezellen 7,8. Ein wichtiger Fortschritt in vivo Zellzyklusstudien wurde von de la Cruz und Edgar, mit der Entwicklung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse lebender diploiden Drosophila Imaginalscheiben 9,10, ein Protokoll, das verwendet wurde, und von vielen Labors geeignet. Diese Technik, wenn sie mit in vivo genetische Abstammung gekoppelt Tracing über induzierbare fluoreszierende Protein Expression und Gewebe spezifische Etikettierung, ermöglicht es, Informationen über Genmanipulation Auswirkungen auf die allgemeine Zellverdopplungszeit, Zellgröße zu erhalten und präzises Timing von Zellzyklus-Phasen bestimmen in vivo 9 , 11. Allerdings ist diese Methode bisher auf die Verwendung der Zellen durchlässig Hoechst 33342 DNA-interkalierenden Farbstoffs zu färben und zu quantifizieren, DNA in lebenden Zellen, die begrenzt Benutzer Zytometer mit einem UV-Laser, der Anregung der Hoechst Farbstoff fließen gestützt hat. Diese werden in der Regel nur in Sorter (dh BD FACS Vanta gefundenge, BD FACSAria) oder teure multicolor benchtop Systemen (zB BD LSR), in der Regel erfordern die Unterstützung durch institutionelle Flow Core Facilities. Wir haben die Hoechst-basiertes Protokoll modifiziert, um eine neue Live-Zell-DNA-Farbstoff von Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet verwenden. Dieser Farbstoff ist kompatibel mit einem violetten 405 nm Laser, häufiger in kleineren Tisch-Analysatoren und in der kleinen Selbstversorger-Tisch-Analysator, der Attune Acoustic Fokussierung Cytometer. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Protokoll für Zellzyklus-Analyse, mit Zelltyp Zellgröße, Zahl und Abstammung Analyse in einer Vielzahl von Geweben Drosophila während der verschiedenen Phasen der Entwicklung mit DyeCycle Violet und die Attune gekoppelt werden kann. Dieses Protokoll erweitert die Anzahl der Zytometern geeignet für eine solche Analyse mit Drosophila Gewebe und gibt Beispiele, wie diese Art von Live-Zellzyklus-Analyse kann für weitere Gewebetypen und Entwicklungsstadien geändert werden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

Durchflusszytometrie wurde in großem Umfang verwendet, um Informationen über DNA-Gehalt in einer Population von Zellen zu erhalten, um die relative Prozentsätze in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu schließen. Diese Technik wurde erfolgreich in den mitotischen Gewebe des Modellorganismus Drosophila melanogaster für genetische Studien von Zellzyklus-Regulation in vivo erweitert. Wenn mit Zelltyp-spezifische fluoreszierende Protein Expression und genetische Manipulationen gekoppelt, kann man detaillierte Informationen über Auswirkungen auf die Zellzahl, Zellgröße und Zellzyklus Phasing in vivo. Doch diese lebenden Zellen-Methode wurde für die Verwendung der Zellen durchlässig Hoechst 33342 DNA-interkalierenden Farbstoffes verlassen, Begrenzen Benutzer Durchflusszytometer mit einem UV-Laser ausgestattet. Wir haben dieses Protokoll geändert werden, um eine neuere lebenden Zellen DNA-Farbstoff, Vybrant DyeCycle Violet, kompatibel mit den häufigeren violett 405nm Laser verwenden. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht eine effiziente Zellzyklusanalyse mit Zelle gekoppeltTyps, der relativen Zellgröße und Zellzahl Informationen in einer Vielzahl von Drosophila Gewebe. Dieses Protokoll verlängert die Nutzungsdauer Zellzyklusanalyse Technik für Live Drosophila Gewebe auf einen kleinen Tisch-Analysator, der Attune akustischen Fokussiervorrichtung Zytometer, die ausgeführt werden und kann auf einem einzelnen-Labormaßstab gehalten werden.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse für ein Larven Flügel Probe, die GFP in der hinteren Hälfte des Gewebes mit dem mitgelieferten GFP-Vorlage. Ähnliche Ergebnisse werden mit der gleichen Gewebetyp und Expressionsmuster für RFP RFP mit dem mitgelieferten Schablone (3A) erhalten. Die zur Verfügung gestellten Vorlagen und Spannungen (Tabelle 2) sind geeignet für die Analyse von Larven Augen (3B), Gehirn und Flügel, sowie Puppen Augen, Gehirn (3D)<...

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Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Ein Protokoll für die Zellzyklus-Analyse lebender<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer beschrieben. Dieses Protokoll liefert gleichzeitig Informationen über die relative Größe der Zellen, Zellzahl, DNA-Gehalt und Zelltyp über Linie Tracing oder gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen<em&gt; In vivo</em&gt;.

Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

13.5K Aufrufe.  University of Michigan. Ein Protokoll für die Zellzyklus-Analyse lebender Drosophila Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer beschrieben. Dieses Protokoll liefert gleichzeitig Informationen über die relative Größe der Zellen, Zellzahl, DNA-Gehalt und Zelltyp über Linie Tracing oder gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen In vivo.

Serie: Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

Forschung

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...