Damos las gracias a Aida de la Cruz para el desarrollo y la enseñanza del protocolo original en que se basa esta versión 10. El trabajo en el laboratorio Buttitta está apoyado por el NIH GM086517.

1. Fly Ganadería <ol><li> Cruz vuela de genotipos deseados en viales de plástico estrechas con 10 ml de levadura-glucosa Medio 3 u otros medios de comunicación ricos en proteínas de su elección. Las amplias herramientas de Drosophila transgénicas disponibles para la expresión específica de tejido y el linaje en el rastreo con expresión de la proteína fluorescente in vivo se describen en detalle en otra parte 4,5. Transfiera los padres a viales frescas todos los días para obtener una serie de 24 colecciones progenie hora, o para la estadificación más precisa, recolectar embriones en placas de agar y la transferencia de larvas recién eclosionadas a viales como se describe 10. Para garantizar condiciones uniformes a través de experimentos y evitar el hacinamiento, el número total de plantas de la F1 en un solo vial no debe ser mayor de 100. Dependiendo del diseño genético del experimento, mantener viales en una incubadora apropiada hasta que la fase de desarrollo deseada. </li><li> Recoger los animales de experimentación: necesitará larvas maduran en la 3 ª larvalestadio (L3), a unos 110 a 120 horas de desarrollo para las disecciones de larvas o prepupa blanco (WPP) para la puesta en escena de pupa exacta. Cambios del ciclo celular dramáticas, incluyendo un cambio a un estado no proliferativo se producen en distintos puntos de tiempo durante la metamorfosis 12,13. Por lo tanto correcta puesta en escena de pupa (a menos de 1 hora del desarrollo) es esencial para el ciclo celular de datos reproducibles durante la metamorfosis. WPP corresponde a 0 horas después de la formación de la pupa (0 h APF) como se muestra en la Figura 1, panel de E. Recoger WPP en una placa de Petri de 35 mm en un Kimwipe doblado húmeda con 2,5 ml de agua para mantener algo de humedad. Edad pupa hasta la etapa (horas APF) deseada a la temperatura adecuada. Tenga en cuenta que el desarrollo procede 1,2 veces más rápido a 29 ° C y 2,2 veces más lentamente a 18 ° C que a la estándar de 25 ° C 14. </li><li> Animales Heat-shock para activar de choque térmico flipasa (hs-FLP) inducida por la recombinación de clones linaje rastreo si es necesario 9,11. Para el choque térmico de larva, sumerjaviales en un baño de agua (regulado a 37 ° C) y garantizar las larvas están completamente sumergidos. Para el choque térmico de pupa, sellar la placa de Petri con Parafilm y totalmente sumérjala en la cubeta de agua. Asegúrese de retirar Parafilm después del choque térmico, para permitir el intercambio de oxígeno suficiente para la supervivencia de los animales. Duración de la de choque térmico depende de la actividad del transgén flipasa utilizado y el número de clones deseados. Nosotros usamos 7-8 min para inducir &quot;pierdan los estribos&quot; linaje trazado clones 15 en larvas con la hs-FLP transgén en el primer cromosoma y 2-4 min de choque térmico de las pupas en placas de 35 mm, mientras que la hs-FLP transgén en el segundo cromosoma requiere un 20 min. choque térmico para obtener un número similar de clones. </li></ol> La tasa de división celular y el momento de la disección determina el tamaño de clon en cada tejido. En condiciones normales, nos encontramos con que los clones inducidos en el ala de larvas con un mínimo de choque térmico 20 (usando el HS-flp transgén en el segundo cromosoma) y disecciónTed 48 horas más tarde, contienen aproximadamente 20-30 clones bien separadas con tamaños que van desde 10 células por clon a dos células por clon, con un promedio de alrededor de cuatro células por clon. En contraste, un 7 min de choque térmico con la misma hs-FLP transgén de pupas en una cápsula Petri a la 0 hora APF diseccionó 36 horas más tarde, los rendimientos de los clones bien separados (aproximadamente 15-25) que van de uno a cuatro células con un promedio de 2,2 células por clon. Tales datos pueden ser utilizados para determinar el tiempo medio de duplicación de células para el tejido en estudio. 2. Disección <ol><li> Transferir suavemente las larvas / pupas a un plato de disección de vidrio transparente que contiene 1X PBS. </li><li> Utilizando un microscopio de disección y mucha luz, agarre suavemente una larva por el abdomen con un fuerte Inox # 5 fórceps, corte el tercio anterior con micro-tijeras, e invertir el tercio anterior presionando la zona interior la boca hacia la parte posterior, mientras que la celebración de la larva cutícula constante (Figura 1A). Retire con cuidado opaque grasa corporal y cualquier intestino restante para aumentar la visibilidad de los tejidos deseados, tales como ala, ojo o el cerebro. Diseccionar los tejidos deseados, eliminar limpiamente alas de la tráquea y la cutícula con unas pinzas, los ojos de la boca-ganchos o el cerebro de los ojos (Figura 1G). </li><li> Para diseccionar pupa, el uso de una pinza para agarrar suavemente una pupa de la punta anterior de la envoltura pupal donde hay una burbuja de aire, para evitar dañar la pupa dentro (Figura 1C). Pinzas o micro-tijeras en la mano opuesta se pueden utilizar para ayudar a posicionar la pupa flotante para agarrar adecuada. Corte limpio a través de la punta posterior de la pupa con micro-tijeras. Este corte transversal se debe hacer en un ligero ángulo hacia la parte dorsal del animal, para liberar la presión interna sin forzar la grasa histolyzed en los tejidos deseados en el tórax y la cabeza. Recorte cuidadosamente a lo largo de la mediana dorsal, evitando las alas y el complejo ojo-cerebro anterior. Retire con cuidado la pupa de la pupacaso, tome el borde posterior de la epidermis de pupa y tirando de ella fuera de la caja de pupa (Figura 1D). Haga un pequeño agujero en la parte anterior cutícula para el complejo ojo-cerebro con fórceps. Usando una pipeta Pasteur de vidrio con una pera de goma, lave suavemente la disección solución PBS a través de la pupa parcialmente cortada para extraer la grasa histolyzed y cualquier tejido intestinal restante. Esto también lubrica eficazmente la pipeta de vidrio con los lípidos y proteínas, lo que reduce la incidencia de los tejidos disecados se pegue al interior de la pipeta de vidrio más tarde. </li><li> Para obtener alas pupal, la cutícula que envuelve el ala y la propia ala debe hacer palanca de la pupa (Figura 1E). Esto se puede hacer mediante la celebración de la pupa hacia abajo por la cabeza con una pinza de fórceps durante el uso de otra a cualquiera de captar la punta más posterior de la cutícula ala y tirando hacia fuera o maniobras del fórceps bajo el ala cerca de la bisagra antes de que se desprenda desde el lado de los la carcasa (Figura 1 E). El ala puede entonces ser cortado o rasgado en la bisagra para quitarlo del cuerpo y poner en una pila de distancia de los canales y otros materiales. </li><li> Para obtener los ojos de pupas o el cerebro, lave la pupa hasta el complejo ojo-cerebro se sale y libre de la pupa (Figura 1F, 1H). Usando una pinza, tire suavemente el ojo pupa fuera del cerebro y salvar el tejido deseado. </li><li> No tome más de 45 minutos para diseccionar cada muestra, ya que los resultados se vuelve menos precisa de las células más largas se dejan en PBS después de la apertura de los animales. </li></ol> 3. La disociación de tejidos y ADN de tinción <ol><li> Utilizando una pipeta Pasteur lubricado, transfiera cuidadosamente los tejidos disecados en 0,5 ml de solución de tinción de ADN en vivo en un tubo de poliestireno de 5 ml (Figura 1G). Transferencia de tan poco como sea posible PBS (menos de 300 l) en la solución de tinción de ADN, como la dilución de tripsina se inhibir la disociación del tejido. </li><li> Incubar los tubos con Shaking a 23 ° C a 500 rpm (usamos un Thermomixer de Eppendorf). </li><li> Incubar durante 70 min, a continuación vórtice suavemente durante 5 segundos a una velocidad media (ajuste de 5). Agitación excesiva puede causar la ruptura celular y escombros forma, mientras que bajo-agitación dará lugar a grupos de células. Devolver las muestras a agitación a 23 ° C a 500 rpm para un adicional de 15 a 20 min antes de vórtex una vez más durante 5 segundos a velocidad 5. </li><li> Para encéfalo y los ojos pupal mayores de 36hAPF, se requiere un protocolo modificado. Disociar tejidos en solución de tinción de ADN a 23 ° C a 500 rpm durante 45-60 min en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. A continuación, uno por uno se disocian manualmente grandes trozos de tejido mediante la transferencia a la disección plato junto con alrededor de 50 l solución de tinción de ADN y de pipeteado rápido hacia arriba y abajo con una pipeta Pasteur dibujado manualmente 16 (de aproximadamente 100-150 m de apertura). Transferir cada espécimen disocian con el resto de la 0,5 ml de solución de tinción de ADN en un tubo de 5 ml. Incubar un 45 adicional-30 Min (hasta 90 minutos de tiempo total de incubación) a 23 ° C con agitación a 500 rpm hasta que grumos ya no son visibles. </li><li> Muestras totalmente disociados deberían tener muy pocos grandes trozos visibles de tejido, aunque tenga en cuenta que la acelular transparente cutícula ala pupal no disociar. </li></ol> 4. Citometría de Flujo <ol><li> Encienda el citómetro Attune y abra el software Attune. El láser del citómetro deben ser entregados a través del menú de inicio, y una prueba de rendimiento diario se deben realizar con bolas de seguimiento de rendimiento con calificaciones adecuadas antes de cada día de la adquisición de datos. Los niveles de líquidos debe ser de al menos la mitad y vaciar los residuos antes de la prueba de rendimiento. Detalles para el arranque, la calibración adecuada y el funcionamiento de la Attune se pueden encontrar en la Guía del usuario Attune ( <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ) </li><li> Diseñar un nuevo template creando 4 gráficos de puntos y 2 histogramas en un espacio de trabajo en blanco con los parámetros indicados en el punto 4.3, o seleccione una plantilla diseñada previamente adecuado para el experimento e indique el número de muestras que deben recogerse. Hemos proporcionado Attune plantillas (archivos. Obtener el formato) para el análisis del ciclo celular Drosophila en vivo con Vybrant DyeCycle Violeta y GFP o RFP expresión en el Apéndice I. </li><li> Las plantillas que se ofrecen incluyen cuatro gráficos de puntos y dos histogramas con los parámetros indicados en la figura 2. Canales para la detección incluyen: FSC y SSC - dispersión frontal y lado de dispersión que indica el tamaño celular y la complejidad de membrana, VL1 altura (H), ancho (W) y el área (A) - que indica excitación láser violeta de Violet tinción DyeCycle el ADN, y BL1 -A - Blue laser Canal 1 Área, lo que indica la fluorescencia de GFP. La plantilla proporcionada para el análisis de RFP es idéntica a la plantilla para el análisis de GFP, excepto que se utiliza el canal de láser azul 3 (BL3-A), que es optimizaciónzed para detectar RFP. </li><li> Los diagramas de puntos en las plantillas tienen puertas para restringir el análisis a las poblaciones deseadas y para limitar los desechos de células y grupos de análisis (Figura 2). Puerta 1 excluye escombros y grupos sobre la base de SSC frente a FSC (Figura 2A). Gate 2 excluye las células no teñidas, células apoptóticas G1 sub y grupos de células en base a la identificación de singletes (VL1Area vs VL1Width) (Figura 2B). Puerta 3 es una puerta derivada, que abarca las células dentro de las puertas 1 y 2, e identifica GFP (o RFP) las células negativas vs contenido de ADN basado en VL1Height (Figura 2C). Puerta 4 es una puerta derivada, que abarca las células dentro de las puertas 1 y 2, e identifica GFP (o RFP) células positivas vs contenido de ADN (Figura 2C). Representaciones gráficas de puntos de tamaño de celda, medido por GFP (o RFP) frente a dispersión frontal (FSC) se utilizan para generar Gates, 5 y 6 (Figura 2D). Los dos histogramas parcela contenido de ADN en el recuento del eje X y celular en la Y-axis para las poblaciones definidas por la Puerta 3 y la Puerta 4. (Figura 2E y 2F) histogramas también pueden ser incluidos para tamaño de la celda si se desea (no mostrado). En los histogramas de tamaño de celda, las poblaciones deben fijarse a Gates, 5 y 6, el trazado del FSC en el eje X y cuenta con el eje y. </li><li> Ajuste de grabación para parar en 10,000 eventos positivos GFP o RFP (esta será la puerta 4, la Puerta derivada de la puerta 1, puerta 2 y la puerta segura de GFP o RFP). El rango va de 6000 - 10.000 GFP acontecimientos positivos han sido tradicionalmente el objetivo de los perfiles de calidad de publicación 9,11. Le sugerimos usar un mínimo de 15 alas o los ojos, que son aproximadamente el 50% GFP positivos para obtener suficiente Puerta 4 eventos 10 para perfiles de alta calidad. Sin embargo, hemos logrado obtener datos claros para el análisis preliminar del ciclo celular de tan sólo 6 alas (Figura 3). Ajuste el volumen de adquisición de 300 l, esto se utilizan alrededor de 460 l de la muestra total de 0,5 ml. Tatabla 2 muestra los valores de umbral y el voltaje adecuados que se proporcionan en la plantilla para el ejemplo en la Figura 2. </li><li> Ejecutar las muestras a la sensibilidad estándar o de alta sensibilidad 100 l / min y grabar. Encontramos poca o ninguna diferencia en nuestro análisis con los diferentes niveles de sensibilidad. Debido a la acústica de enfoque de las células, esta citómetro puede medir con precisión muestras a muy altas velocidades de flujo. A diferencia de citómetros tradicionales, no encontramos datos comprometidos con la adquisición a velocidades de hasta 1500 eventos por segundo. Los archivos de datos grabados generados por el software Attune están en formato. FCS, que es compatible con la mayoría de software de modelado del ciclo celular. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Los histogramas de tamaño de celda y el contenido de ADN para GFP (o RFP) poblaciones positivas y negativas pueden ser comparados. Se pueden superponer manualmente copiando y pegando con el software Adobe Photoshop. Si el eje está configurado en automático, el eje Y se escala con la highest recuento para cada muestra. La superposición de dos gráficos con el eje Y conjunto de autoescala crea una superposición de histogramas con los ejes establecidos para el máximo global para cada población. Esto permite la comparación visual fácil para los cambios relativos en la puesta en fase del ciclo celular, incluso cuando el número de células totales de GFP positivos y negativos poblaciones GFP no son equivalentes (por ejemplo, en la Figura 3B). Alternativamente, una costumbre del eje y (opción manual eje y) se puede ajustar a un valor fijo para los histogramas. En este caso los números de células relativos de dos poblaciones se pueden comparar. A medida que el Attune utiliza un volumen definido de la muestra por ciclo, la cuantificación absoluta de las células para cada ejecución, en cada puerta con porcentajes de la población total, se puede obtener de la tabla de estadísticas generado automáticamente durante la carrera en el espacio de trabajo (por ejemplo, en la Figura 3F ). Las gráficas de puntos e histogramas también puede ser fácilmente capas en el software Attune, simplemente arrastrando y soltando diferentes muestras de thmenú archivo de ejemplo e en la derecha en la gráfica deseada de una muestra abierta de comparación. Sin embargo, para superponer las subpoblaciones desde dentro de una sola muestra (es decir, GFP y GFP positiva negativa dentro de la misma muestra), utilizamos Photoshop. </li><li> Dos métodos se pueden utilizar para encontrar porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular de una población. El método de aproximación se basa en las regiones definidas por el usuario para delinear los límites de G1, S, G2 y G2&gt; picos. Este método permite que las estimaciones rápidas y fáciles de porcentajes en las regiones definidas por el usuario (Figura 3E). Nos pusimos nuestras regiones sobre la base de una prueba directa de células de Drosophila Kc, etiquetado para la fase S con etinil-desoxiuridina (UDE) la incorporación. El segundo método utiliza el software de modelado de tercera parte para la estimación de la distribución del ciclo celular. Se utilizó el software ModFitLT (Verity Software House), por ejemplo, en la Figura 3F. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. 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A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo se describe aquí permite el análisis de ciclo celular, tamaño de celda relativo y el número relativo de células en los tejidos de Drosophila en directo en diversas etapas de desarrollo. Cuando este análisis se acopla con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico o linaje de rastreo, la información detallada se puede obtener sobre las respuestas celulares a ciclo celular discreta o perturbaciones de crecimiento. Como prueba de principio, hemos desbaratado quiescen...

La citometría de flujo puede ser utilizado para las mediciones de la viabilidad celular, tamaño de la celda relativa, contenido de ADN y la expresión de la proteína fluorescente en las poblaciones de células vivas. Debido a la replicación de ADN nuclear durante la fase S, la información sobre el contenido de ADN en una población de células puede ser usado para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular 1-3. Este método se ha convertido en una piedra angular del análisis del ciclo celular en sistemas modelo de la levadura a los mamíferos. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un excelente sistema modelo para la genética en los análisis in vivo de la regulación del ciclo celular. Las amplias herramientas genéticas disponibles en las moscas permiten manipulaciones tejido elegante específicos y regulado temporalmente de los reguladores del ciclo celular, junto con la fluorescente linaje a base de proteínas vivo trazado 4-6. La citometría de flujo se ha utilizado para estudiar el contenido de ADN en un número de tipos de células de Drosophila, incluyendo endoreplcélulas cultivadas y células mitóticas icating 7,8. Un avance importante para los estudios del ciclo celular in vivo fue hecha por de la Cruz y Edgar, con el desarrollo de un protocolo para el análisis citométrico de flujo de discos imaginales de Drosophila diploides vivo 9,10, un protocolo que se ha utilizado y adaptado por muchos laboratorios. Esta técnica, cuando se combina con linaje genético en el rastreo in vivo a través de la expresión de proteína inducible fluorescente y el etiquetado específico de tejido, permite obtener información acerca de la manipulación de genes efectos sobre el tiempo de duplicación celular global, tamaño de celda y para determinar el momento exacto de fases del ciclo celular in vivo 9 , 11. Sin embargo, este método se ha basado hasta ahora en el uso de la célula permeable al colorante Hoechst 33342 ADN-intercalante para teñir y cuantificar el ADN en las células vivas, lo que ha limitado los usuarios fluyan citómetros con un láser UV capaz de excitar el colorante Hoechst. Estos generalmente se encuentran sólo en los clasificadores (es decir BD FACS Vantage, BD FACSAria) o costosos sistemas de sobremesa multicolor (es decir BD LSR), por lo general requieren el apoyo de las instalaciones básicas de flujo institucionales. Hemos modificado el protocolo Hoechst basado en utilizar un nuevo tinte de ADN de células vivas de Invitrogen, Vybrant DyeCycle violeta. Este colorante es compatible con un láser violeta de 405 nm, más común en los analizadores de sobremesa más pequeños y están disponibles en el pequeño analizador de sobremesa autónomo, la acústica Attune Centrándose citómetro. Aquí se presenta un protocolo detallado para el análisis del ciclo celular que se puede acoplar con el tipo de células, tamaño de celda, el número de células y el análisis de linaje en una variedad de tejidos de Drosophila durante las diversas etapas de desarrollo utilizando DyeCycle violeta y la Attune. Este protocolo se expande el número de citómetros adecuados para este tipo de análisis con los tejidos de Drosophila y proporciona ejemplos de cómo este tipo de análisis del ciclo celular en vivo puede ser modificado para tipos de tejidos adicionales y etapas de desarrollo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para obtener información sobre el contenido de ADN en una población de células, para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular. Esta técnica se ha ampliado con éxito a los tejidos mitóticas del organismo modelo Drosophila melanogaster para los estudios genéticos de la regulación del ciclo celular in vivo. Cuando se combina con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico y manipulaciones genéticas, se puede obtener información detallada acerca de los efectos sobre el número de células, el tamaño celular y el ciclo celular en la eliminación in vivo. Sin embargo este método en vivo de células se ha basado en el uso de la célula permeable al colorante Hoechst 33342 ADN-intercalante, limitar a los usuarios a citómetros de flujo equipado con un láser UV. Hemos modificado este protocolo para utilizar un tinte más reciente en vivo de células de ADN, Vybrant DyeCycle Violet, compatible con el láser violeta 405nm más común. El protocolo presentado aquí permite el análisis del ciclo celular eficiente junto con célulastipo, tamaño relativo de células y la información de número de células, en una variedad de tejidos de Drosophila. Este protocolo se extiende la técnica útil para el análisis del ciclo celular de Drosophila tejidos en vivo para un pequeño analizador de sobremesa, la acústica Attune citómetro de enfoque, que puede ser gestionado y mantenido en una escala de laboratorio-único.

La Figura 2 muestra los resultados representativos de una muestra de ala larvas, que expresan GFP en la mitad posterior del tejido, usando la plantilla proporcionada GFP. Se obtienen resultados similares con el mismo tipo de tejido y el patrón de expresión de RFP usando la plantilla proporcionada RFP (Figura 3A). Las plantillas y los voltajes suministrados (Tabla 2) son adecuados para el análisis de los ojos de larvas (Figura 3B), cerebros y las alas, así como los o...

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Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Un protocolo para el análisis del ciclo celular en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos usando la Acoustic Attune citómetro de enfoque se describe. Este protocolo proporciona simultáneamente información sobre el tamaño relativo de células, el número de células, y el tipo de contenido de ADN celular a través de rastreo de linaje o expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes<em&gt; In vivo</em&gt;.

Teléfono directo Análisis de Ciclo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos que usan la acústica Attune Centrándose citómetro y Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

13.5K vistas.  University of Michigan. Un protocolo para el análisis del ciclo celular en vivo de Drosophila Tejidos usando la Acoustic Attune citómetro de enfoque se describe. Este protocolo proporciona simultáneamente información sobre el tamaño relativo de células, el número de células, y el tipo de contenido de ADN celular a través de rastreo de linaje o expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes In vivo.

Video: Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

Investigación

Biología

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Evaluación de la expresión de GFP y viabilidad mediante el Tali basada en imágenes citómetro

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...