Die heterologe Expression von Connexinen und Innexinen in Xenopus-Eizellen ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Analyse biophysikalischer Eigenschaften von Gap Junctions. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, einen High-Side-Strommessansatz zu verwenden, der für doppelte Standortspannungsklemmen geeignet ist. Das Verfahren wird von Yuan Shui, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert.
Sobald 70 bis 80% der Eizellen entlaubt sind, dekantieren Sie die Enzymlösung, indem Sie den Schlauch vorsichtig kippen. Waschen Sie die Eizellen fünfmal, indem Sie das Röhrchen mit ND96-Lösung füllen und dann die Lösung dekantieren. Nach der letzten Wäsche die Eizellen in eine 60-Millimeter-Petrischale mit ND96-Lösung geben.
Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus sauberem Glas, um große, gesund aussehende Eizellen zu pflücken und in eine 60-Millimeter-Petrischale mit ND96-Lösung zu übertragen, die mit Natriumpyruvat und Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Bereiten Sie eine Eizellinjektionsschale vor, indem Sie ein kleines Stück Nylonnetz auf den Boden einer 35-Millimeter-Petrischale kleben. Füllen Sie die Eizellinjektionsschale etwa zur Hälfte mit ND96-Lösung, ergänzt mit Pyruvat und Penicillin-Streptomycin.
Legen Sie dann 25 bis 30 Eizellen in Reihen in die Petrischale. Füllen Sie eine Injektionsmikropipette mit leichtem Mineralöl und setzen Sie sie in den Mikropipettenhalter des Injektors ein. Übertragen Sie die cRNA von einem der gespeicherten Aliquots durch Pipettieren auf die Innenseite einer Petrischalenabdeckung oder -unterseite.
Drücken Sie die Fülltaste im Injektor-Controller, um das cRNA-Tröpfchen in die Spitze der Mikropipette zu aspirieren. Drücken Sie dann die Injektionstaste, um die cRNA zu injizieren. Übertragen Sie die injizierten Eizellen in eine neue Petrischale, die ND96-Lösung enthält, ergänzt mit Pyruvat- und Penicillin-Streptomycin.
Halten Sie sie ein bis drei Tage lang bei 15 bis 18 Grad Celsius in der Umweltkammer. Ersetzen Sie die Lösung täglich, indem Sie die Eizellen in eine neue Petrischale geben. Verwenden Sie zwei feine Pinzetten, um die transparente Zottenmembran, die die Eizelle umhüllt, vorsichtig abzuziehen.
Legen Sie dann zwei Eizellen pro Vertiefung in eine Eizellpaarungskammer, die die ND96-Lösung enthält. Schließen Sie die Differenzspannungssonde und die Stromkabel an die Modellzelle an. Verbinden Sie dann die roten und schwarzen Buchsen mit dem mitgelieferten Jumper mit der Differenzspannungssonde und verbinden Sie eines der beiden Beine des Jumpers mit einem der Pins in der Modellzelle.
Verbinden Sie den Erdungsdraht in der Modellzelle von der Erdungskreisbuchse des Verstärkers mit dem Kabel. Drehen Sie die VM-Offset- und VE-Offset-Regler auf Null der Membranspannungs- und Membranstrommesser. Schalten Sie die Klemme von aus auf schnell oder langsam und drehen Sie die Verstärkungsanzeige im Uhrzeigersinn auf ein Niveau, das es ermöglicht, die Spannungselektroden- und Badelektrodenmessgeräte des Verstärkers auf Null zu setzen.
Führen Sie ein einfaches Erfassungsprotokoll aus, das einige Spannungsschritte enthält, um zu bestätigen, dass sich die im Membranspannungsmesser angezeigte Spannung gemäß dem Erfassungsprotokoll ändert und dass Spannungs- und Stromspuren in Clampex ordnungsgemäß angezeigt werden. Legen Sie eine Petrischale mit den gepaarten Eizellen in den Petrischalenbehälter der Aufnahmeplattform. Wählen Sie ein Paar Eizellen und drehen Sie die Petrischale bei Bedarf, so dass sich die beiden Eizellen in linker und rechter Richtung befinden.
Verriegeln Sie die Bühne durch ihre magnetische Basis. Platzieren Sie eine Referenzelektrode in der Nähe des Randes der Petrischale in Richtung der Benutzerseite. Schließen Sie dann die Referenzelektrode an die schwarze Buchse in nur einem der beiden Differenzspannungssonden an.
Nehmen Sie ein Paar Glasmikropipetten, brechen Sie mit einem Diamantritzer ein wenig von der Spitze ab und glätten Sie die Spitzenkante durch Feuerpolieren. Halten Sie die Mikropipette über die Flamme eines Alkoholbrenners und biegen Sie sie in einem glatten Winkel in etwa einem Zentimeter Entfernung von der Spitze. Füllen Sie die Glaspipette vollständig mit ND96-Lösung ab und stecken Sie sie dann in einen vorgefüllten Mikroelektrodenhalter.
Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im System vorhanden sind. Stecken Sie den Zwei-Millimeter-Pin des Mikroelektrodenhalters in die Zwei-Millimeter-Buchse eines Differenzspannungs-Elektrodenverbindungsdrahtes. Klemmen Sie die Zwei-Millimeter-Buchse an eine magnetische Klemme und richten Sie die Spitze der Differenzspannungselektrode auf eine der beiden Eizellen.
Stecken Sie den Ein-Millimeter-Pin des Differenzspannungselektroden-Anschlussdrahtes in die rote Buchse der Differenzspannungssonde auf der gleichen Seite. Bereiten Sie die Spannungs- und Stromelektroden aus den Glaskapillaren vor und füllen Sie sie mit Kaliumchloridlösung nach. Setzen Sie dann die Elektroden in die Elektrodenhalter ein, die mit den Verstärkern geliefert werden.
Senken Sie die Elektroden in die Badlösung und drehen Sie die VM-Offset- und VE-Offset-Zifferblätter auf Null die Membranspannungs- und Membranstrommesser. Überprüfen Sie den Elektrodenwiderstand, indem Sie VM-Elektrodentest und VE-Elektrodentest drücken. Führen Sie die Strom- und Spannungselektroden in die Eizellen ein und beobachten Sie die negativen Membranpotentiale.
Als nächstes bestätigen Sie im Klemmabschnitt des Verstärkers, dass sich die DC-Verstärkung in der In-Position befindet. Drehen Sie den Verstärkungsregler im Uhrzeigersinn auf ein Niveau, das eine ordnungsgemäße Spannungsklemme ermöglicht, und drehen Sie den Klemmschalter von Aus auf Schnell. Führen Sie abschließend ein Erfassungsprotokoll aus.
Ein Diagramm des Eizellexperiments ist hier dargestellt. Ab einer Haltemembranspannung von minus 30 Millivolt werden negative und positive Membranspannungsschritte an Eizelle 1 angelegt, während Eizelle 2 bei einer konstanten Membranspannung von minus 30 Millivolt gehalten wird. Die Transjunktionsspannung oder Vj ist definiert als die Membranspannung von Eizelle 2 abzüglich der Membranspannung von Eizelle 1.
Die repräsentativen Bilder zeigen die Lj-Spuren der Probe und die daraus resultierende normalisierte transjunctionale Spannungsbeziehung der transjunctionalen Leitfähigkeit von UNC-9 homotypischen Gap Junctions. Proben-Lj-Spuren und die daraus resultierende normalisierte Gj-Vj-Beziehung von UNC-7b homotypischen Gap Junctions sind hier dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass sich diese beiden Arten von Gjs in der Vj-abhängigen Ij-Inaktivierungsrate, der Vj-Abhängigkeit und der Menge an Rest-Gj unterscheiden.Während des Verfahrens ist es sehr wichtig sicherzustellen, dass das Differenzspannungselektrodensystem keine Luftblasen aufweist und seine Spitze sehr nahe an die Eizelle gerichtet ist und die Spannungs- und Stromelektroden einen Widerstand von etwa einem Mikroohm haben.
Unsere Technik ist einfach zu implementieren. Es könnte von besonderem Interesse für diejenigen Labore sein, die neu daran interessiert sind, Xenopus-Eizellen zur Untersuchung von Gap Junctions zu verwenden.
