Diese Studie war Teil der Agriculture and Agri-Food Canada A-Base Projekt &quot;Entwicklung von Hochdurchsatz-Techniken für Fleischproben, um die Lücke für multivariate phenomic Qualitätsmerkmale in Marker gestützte Selektion zu reduzieren.&quot; Der erfahrene Unterstützung des Beef-Einheit und Fleischverarbeitung Mitarbeiter an der Forschungsstelle Lacombe sind herzlich willkommen. Die Autoren wollen auch die dedizierte technische Unterstützung von Christine Burbidge-Boyd, Fran Costello, Glynnis Croken und Rhona Thacker danken.

1. Steak-Sammlung <ol><li> Nach Befundung nach 24 Stunden - 48 Stunden nach der Schlachtung, die longissimus Muskel (entweder die Brust-und / oder lumborum Ende) aus Rindfleisch Kadaver entfernt und gesammelt zur Qualitätsanalyse. </li><li> Der Muskel wird des subkutanen Fettgewebes und eckigen getrimmt. Der Muskel wird dann in 2,5 cm (1 Zoll) Steaks nach Sicherheit und Umgang mit Lebensmitteln Protokolle geschnitten. Nach dem Schneiden der einzelnen Steaks werden entsprechende Etiketten (Tier-Nummer, Seite, Muskel Ort oder Zeit) auf dem jeweiligen Steak platziert. </li><li> Steaks werden dann für die Lagerung vorbereitet. Wenn sie frisch bleiben, sind sie auf einem Tablett platziert und ins Grill. Wenn die frische Steaks nicht sofort zubereitet werden, müssen sie mit Kunststoff überzogen werden, bis Kochen beginnen kann, um Austrocknung zu verhindern. Wenn Steaks in einem kühleren Jahre alt sein, oder gefroren sind, wird das Gewicht auf zwei Dezimalstellen, bevor sie in einer Sauerstoff-undurchlässige Vakuum-Paket ba platziert aufgezeichnetg und versiegelt unter Verwendung eines Vakuum-Verpackungsmaschine. Steaks werden dann in ihren jeweiligen Langzeitlagerung Orten platziert. </li></ol> 2. Kochen Vorgehensweise <ol><li> Wenn die Probe eingefroren war, aus dem Gefrierschrank und in einem 4 ° C über Nacht auftauen Kühler zu entfernen. </li><li> Am Tag des Kochens, Vorheizen eine offene Feuerstelle Grill bis 210 ° C für Probe kochen, und bereiten die Temperatur-Logger und Computer, indem Sie die Thermoelemente in die Auslässe der Scan-Einrichtung. Fetten Sie den Grill mit Gemüse Verkürzung ca. 10 min vor dem Kochen beginnt. </li><li> Vor Beginn zu kochen, entfernen Sie Steaks aus dem Kühler. Entfernen Sie die Probe aus der Verpackung, und tupfen Sie überschüssige Feuchtigkeit aus dem Steak mit Papiertuch. Notieren Sie sich die Roh-Gewicht des Steaks auf zwei Dezimalstellen. </li><li> Einfügen eines Thermoelements in den Mittelpunkt des Steaks entlang seiner Längsachse. Starten Sie die Scan-to-Thermoelement Kochen Daten aufzuzeichnen. </li><li> Legen Sie dasSteaks auf dem Grill, hält das Thermoelement parallel zu der flachen Kochfläche des Steak und Grill. Wenn die Sonde nicht parallel gehalten wird, kann es zu einer fehlerhaften Temperaturmessungen führen. </li><li> Kochen Steaks auf eine Innentemperatur von 35,5 ° C, dann drehen Sie die Probe vorbei und weiter kochen zu einem endgültigen Innentemperatur von 71 ° C Sobald die Innentemperatur 71 ° C wird die Probe vom Grill und ziehen Sie das Thermoelement aus dem Steak. </li><li> Wenn ein Koch-Gewicht erwünscht ist, lassen Sie das Steak etwas abkühlen lassen (1-2 min), dann trocknen Sie die Probe mit einem Papiertuch, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen und wiegen Probe auf zwei Dezimalstellen. </li><li> Wenn Kochen Daten erforderlich sind, speichern Sie die Thermoelement-Scandaten. </li></ol> 3. Winkeleinstellvorrichtung und Probenvorbereitung <ol><li> Während die Probe noch warm vom Grill einen Schnitt 1 - 2 cm vom seitlichen Ende des Steaks einen Vierkant erstellen. </li><li> Ein 5 cm Abschnitt über die width des Steaks wird mit einem &quot;Probe Dimensionierung box&quot; mit einem Messer Kerbe an 5 cm parallel zur ursprünglichen Schnitt hergestellt. </li><li> Die Orientierung der Muskelfasern Winkel kann, indem ein Winkelmesser auf dem Messer geschnittenen Oberfläche des Steaks gemessen werden. </li><li> Die variable Winkel Abschneidkasten wird dann auf den entsprechenden Winkel der Probe, indem die untere Metallplatte mit den unteren Löchern zur Führung der doppelten Klingenmesser benutzerspezi. Ziehen Sie die Knöpfe, um die untere Metallplatte an der entsprechenden Winkel zu sichern. </li><li> Platzieren Sie die 5 cm Abschnitt des Steaks in den Schneidbereich der variablen Winkel Abschneidkasten so dass die Muskelfaser Richtung parallel zu dem Winkel der Doppelklingen-Messer ist. </li><li> Die doppelte Klingenmesser wird eine 1 cm Schicht über der vorher geschnittenen 5 cm Stück geschnitten, so dass das Messer durch die gesamte Probe in dem entsprechenden Winkel übergeben. Wenn Sie das Steak, sicherzustellen, dass es berühren den Rand der Schnittfläche in der Nähe derBenutzer, wird als Schneidebewegung das Steak zum Benutzer hin zu ziehen. </li><li> So schneiden, legen Sie die Doppel-Blatt Messer in den Schneid-Box und ziehen Sie das Messer, um das Fleisch in eine 1 cm Streifen geschnitten. Um zu verhindern, Zerreißen des Fleisches, verwenden Sie eine leichte Sägebewegung und ziehen Sie das Messer in Richtung des Benutzers. Halten die Spitzen der Messer gegen eine Kante der Führungsplatte gleich Schneiden Proportionen zu erhalten. </li><li> Das Ergebnis sollte eine warme, 1 cm dicken Scheibe, die 5 cm lang ist, wobei die Fasern durchweg parallel zur Scheibe. Diese Scheibe wird dann für Scheibe Querkraft Analyse der Textur in Fleisch verwendet. </li></ol> 4. Querkraftbemessungswerte Analysis <ol><li> Um Querkraft Analyse zu bestimmen, verwendet die Scheibe Querkraft-Protokoll (SSF) die 1 cm mal 5 cm schneiden mit dem variablen Winkel Schneidkasten erhalten. Mit einem Texture Analyser Maschine mit einem Flachstahlschere Scheibe Klinge, wird die Analyse auf der warmen Scheibe durchgeführt. </li><li> Bereiten Sie das Texture Analyzer mit einem 50 kg-Wägezelle und Satzdie Scherung Abstand bis 48 mm, mit einem Kreuz-Geschwindigkeit von 500 mm / min. </li><li> Die Schere wird einmal durchgeführt, die senkrecht zu den Muskelfasern, um eine genaue Analyse der maximalen Kraft, die zum Abscheren der Fasern in der Schicht bereitzustellen. </li><li> Sobald die Scheibe wurde komplett durch das Zentrum geschert, speichern und die Daten aufzuzeichnen. </li></ol>

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	<li>Jayasooriya, S. D., Torley, P. J., D'Arcy, B. R., Bhandari, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high+power+ultrasound+and+ageing+on+the+physical+properties+of+bovine+Semitendinosus+and+Longissimus+muscles.">Effect of high power ultrasound and ageing on the physical properties of bovine Semitendinosus and Longissimus muscles.</a> Meat Science. 75, 628-639 (2007).</li><li>Koohmaraie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+proteinases+and+meat+aging.">Muscle proteinases and meat aging.</a> Meat Science. 36, 93-104 (1994).</li><li>Lepetit, J., Culioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+meat.">Mechanical properties of meat.</a> Meat Science. 36, 203-237 (1994).</li><li>Honikel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+methods+supported+by+OECD+and+their+use+in+Mediterranean+meat+products.">Reference methods supported by OECD and their use in Mediterranean meat products.</a> Food Chemistry. 59, 573-582 (1997).</li><li>Monin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+methods+for+predicting+quality+of+whole+meat.">Recent methods for predicting quality of whole meat.</a> Meat Science. 49, S231-S243 (1998).</li><li>Shackelford, S., Wheeler, T., Koohmaraie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+slice+shear+force+as+an+objective+method+of+assessing+beef+longissimus+tenderness.">Evaluation of slice shear force as an objective method of assessing beef longissimus tenderness.</a> Journal of Animal Science. 77, 2693-2699 (1999).</li><li>Ju&#225;rez, M., Hui, Y. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+Shear+Force.">Slice Shear Force.</a> Beef Facts. , (2009).</li><li>Henrickson, R. L., Mjoseth, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenderness+variation+in+two+bovine+muscles.">Tenderness variation in two bovine muscles.</a> Journal of Animal Science. 23, 325-331 (1964).</li><li>Ju&#225;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+relative+contribution+of+ante-+and+post-mortem+factors+to+the+variability+in+beef+texture.">Quantifying the relative contribution of ante- and post-mortem factors to the variability in beef texture.</a> Animal. FirstView, 1-10 (2012).</li><li>Shanks, B. C., Wulf, D. M., Maddock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+note:+The+effect+of+freezing+on+Warner-Bratzler+shear+force+values+of+beef+longissimus+steaks+across+several+postmortem+aging+periods.">Technical note: The effect of freezing on Warner-Bratzler shear force values of beef longissimus steaks across several postmortem aging periods.</a> Journal of Animal Science. 80, 2122-2125 (2002).</li><li>Lawrence, T. E., King, D. A., Obuz, E., Yancey, E. J., Dikeman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electric+belt+grill,+forced-air+convection+oven,+and+electric+broiler+cookery+methods+for+beef+tenderness+research.">Evaluation of electric belt grill, forced-air convection oven, and electric broiler cookery methods for beef tenderness research.</a> Meat Science. 58, 239-246 (2001).</li><li>Aalhus, J., Ju&#225;rez, M., Aldai, N., Uttaro, B., Dugan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meat+preparation+and+eating+quality.">Meat preparation and eating quality.</a> , 1058-1063 (2009).</li><li>Sa&#241;udo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+slaughter+weight,+breed+type+and+ageing+time+on+beef+meat+quality+using+two+different+texture+devices.">The effects of slaughter weight, breed type and ageing time on beef meat quality using two different texture devices.</a> Meat Science. 66, 925-932 (2004).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Der Winkel einstellbar Box sorgt der SSF Klinge immer schert Muskelfasern bei einer wahren senkrechten Winkel, anstatt etwa senkrecht, die mit einem festen Winkel von 45 ° Schnitt 8 passieren konnte. Die Anwendung des variablen Winkel schneiden Box ermöglicht eine genauere Darstellungen der maximalen Querkraft in einer Probe, und es ist auf dieser Grundlage zu verbessern objektive Qualitäts-Analyse-Techniken, dass die Variable Winkelschnittgerät Box entwickelt wurde. Darüber hinaus ermöglicht die breite...

Zärtlichkeit ist eines der wichtigsten Qualitätsmerkmale in Fleisch 1. Inkonsistenz in Rindfleisch Zärtlichkeit hat als eines der wichtigsten Probleme der Rindfleisch-Industrie 2 identifiziert worden. Die Warner-Bratzler Querkraft (WBSF) Test, durch eine dreieckige Loch in einem präzise bearbeitete Scherplatte gekennzeichnet, ist die am weitesten verbreitete Methode zur sensorischen Fleisch Zärtlichkeit 3,4 zeigen, wie es die instrumentelle Verfahren, das wohl die beste gezeigt hat, ist Korrelation mit sensorischen Panel Partituren für Fleisch Zähigkeit 5. Allerdings hat die Scheibe Querkraft-Protokoll (SSF) werden eine wichtige Technik für die Analyse von Muskel-Textur und Zärtlichkeit 6, als Alternative zu den Standard-Protokoll WBSF 7. Es ist vorteilhaft in Fällen, in denen eine schnelle Analyse oder eine hohe Anzahl von Abtastwerten verarbeitet werden müssen. Für die SSF, wird nur ein Kern aus dem Steak gemacht, wenn es noch warm ist, im Vergleich zu den mehreren Kernen (3-6) aus dem Steak in der Regel nach hinten genommener 24 Stunden von Kälte für die WBSF 6. Aus dieser eine Scheibe, analysiert der SSF die durchschnittliche Beschaffenheit des gesamten Steak 8, wie sich herausgestellt hat, dass Empfindlichkeit zwischen den lateral nach medial Seiten des Steaks 9 variiert, mit der Mitte und in der Mitte mit Steaks die beste Darstellung für mittlere WBSF . Der Sturz des SSF ist, dass innerhalb eines Steak, von der lateralen zur medialen Seite, gibt es Unterschiede in den Scherkraftwerten 9, aber durch die konsequente Verwendung der Dimensionierung Box zu 5 cm Abschnitte zu machen, kann es Variabilität, die kommen könnten reduzieren Verwendung von verschiedenen Abschnitten des Steak. Da jedoch einige Steaks verschiedenen Größen gibt, kann ein 5 cm Scheibe in verschiedenen Orten auf das Steak, die dann beeinflussen Scherkraftwerten 10 auftreten könnten. Auf der anderen Seite ermöglicht eine Abschneidkasten ausgebildet, um den Abschnitt in der SSF Protokoll analysiert werden erhalten nur 2 feste Winkel, 45 ° und 90 °, jedoch MuskelFaserorientierung Veränderungen innerhalb Steaks und innerhalb des Muskels 11. Shackelford und Wheeler 12 festgestellt, dass die durchschnittliche longissimus Winkel 43,8 °, die in der Nähe von 45 ° war und daher als angemessen, wenn Proben wurden immer von der gleichen Stelle gesammelt war. Allerdings Derington et al. 11 berichtet einen Bereich in dem Winkel der Fasern entlang des Longissimus-Muskels zwischen 33,1 ° und 53,9 °. Somit wird, wenn, für Forschungszwecke, müssen mehrere Steaks von demselben Tier zu analysierenden Zuweisen aller Faser Winkel 45 ° oder 90 ° verringert möglicherweise Genauigkeit. Die Verwendung von einem variablen Winkel Abschneidkasten kann eine genauere Darstellung der maximalen Scherkraft, die Möglichkeit hat, zu messen und den Schnittwinkel ermöglicht die Scheibe konsequent parallel laufen mit den Muskelfasern.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Packager</td>
			<td>Koch Equipment, Kansas City, MO, USA</td>
			<td>Model UV2100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Winpak Ltd., Winnipeg, MB, Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouples and Scanning Device</td>
			<td>Agilent / Hewlett Packard, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>34970A Data Acquisition Switch Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grill</td>
			<td>Garland Commercial Ranges Ltd., Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>Model ED-30-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crisco Vegetable Shortening</td>
			<td>The J.M. Smucker Company, Orrville, OH, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample sizing box</td>
			<td>G-R Manufacturing Co., Manhattan, KS, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angle adjustable box</td>
			<td>Innovation Centre, Red Deer College, Red Deer, AB, Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texture Analyzer Machine</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>Model TA-XT Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Load Cell, 50 kg</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-XT Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USDA Warner-Bratzler knife w/guillotine block</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat rectangle Blade for Slice Shear Force</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-7C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing an angle adjustable cutting box for analyzing slice shear force in meat

Die Forschung zeigt, der Faserwinkel des Longissimus-Muskels kann schwanken, je nach Lage in einem Steak und in den Muskel. Anstelle der ursprünglichen festen 45 ° oder 90 ° Schnittwinkel zum Testen Scherkraft kann eine variable Winkel Abschneidkasten so eingestellt, wobei die Winkel der Messer der Faserwinkel von jeder Probe entsprechen. Innerhalb von 2 min nach dem Kochen auf eine Innentemperatur von 71 ° C auf einem Siemens-Martin-Grill bei 210 ° C, eine 1 cm mal 5 cm Kern aus dem Steak geschnitten wird, parallel zur Muskelfaser Richtung unter Verwendung von 2 Messerklingen Satz 1 cm auseinander. Dieses warme Kern wird dann an die Scheibe Querkraftbemessungswerte Protokoll (SSF) unterzogen, um Fleisch Textur bewerten. Die Verwendung der variablen Winkel Abschneidkasten und der SSF-Protokoll stellt eine genaue Darstellung der maximalen Scherkraft, wie die Scheibe und Muskelfasern konsequent parallel sind. Daher ist die variable Winkel schneiden Feld in Verbindung mit dem SSF-Protokolls kann als High-ten verwendet werdenroughput Technik genau zu evaluieren Zartheit des Fleisches in verschiedenen Orten der longissimus Muskel-und möglicherweise auch in anderen Muskeln.

Thirty-one fertigen kommerziellen Rindfleisch Ochsen geschlachtet wurden und deren Schlachtkörper (528-601 kg) aufgeteilt wurden. Um Schwankungen der Zärtlichkeit schaffen, wurden der rechten Seite sofort bei 2 ° C gelagert, während die linken Seiten wurden bei 10 ° C für 3 Stunden und dann bei 2 ° C gehalten Die longissimus Muskeln von rechten und linken Seite wurden 24 Stunden nach der Schlachtung entfernt. Proben aus den rechten Seiten (&quot;TOUGH&quot;-Behandlung) wurden analysiert, an diesem Tag, w...

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Introducing an Angle Adjustable Cutting Box for Analyzing Slice Shear Force in Meat

Scheibe Querkraft ist eine Referenzmethode für Rindfleisch Textur-Analyse. Mit einem Winkel verstellbar Schneidkasten erhöhen könnte ihre Richtigkeit zu Forschungszwecken. Die Ergebnisse von verschiedenen Orten innerhalb des<em&gt; Longissimus</em&gt; Muskel zeigen eine hohe Korrelation mit Warner-Bratzler Querkraft Methodik und hohem Potenzial Anpassungsfähigkeit für unterschiedliche Muskeln.

Die Einführung eines Winkel einstellbar Cutting Box zur Analyse Scheibe Querkraftbemessungswerte in Fleisch

Research indicates the fibre angle of the longissimus muscle can vary, depending upon location within a steak and throughout the muscle. Instead of using ...

introducing-an-angle-adjustable-cutting-box-for-analyzing-slice-shear

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  Agriculture and Agri-Food Canada. Scheibe Querkraft ist eine Referenzmethode für Rindfleisch Textur-Analyse. Mit einem Winkel verstellbar Schneidkasten erhöhen könnte ihre Richtigkeit zu Forschungszwecken. Die Ergebnisse von verschiedenen Orten innerhalb des Longissimus Muskel zeigen eine hohe Korrelation mit Warner-Bratzler Querkraft Methodik und hohem Potenzial Anpassungsfähigkeit für unterschiedliche Muskeln.

Serie: Introducing an Angle Adjustable Cutting Box for Analyzing Slice Shear Force in Meat

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Forschung

Biologie

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Erkennung und Charakterisierung der Protein-Selbstmontage in Vivo durch Durchflusszytometrie

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Automated Charting of the Visual Space of Housefly Compound Eyes

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands of visual units called ommatidia. Each ommatidium samples the optical information from a small solid angle, with an approximate Gaussian-distributed sensitivity (half-width on the order of 1&#730;) centered around a visual axis. Together, the ommatidia gather the visual information from a nearly panoramic field of view. The spatial distribution of the visual axes thus determines the eye's spatial resolution. Knowledge of the optical organization of a compound eye and its visual acuity is crucial for quantitative studies of neural processing of the visual information. Here we present an automated procedure for mapping a compound eye's visual axes, using an intrinsic, in vivo optical phenomenon, the pseudopupil, and the pupil mechanism of the photoreceptor cells. We outline the optomechanical setup for scanning insect eyes and use experimental results obtained from a housefly, Musca domestica, to illustrate the steps in the measurement procedure.

The protocol here describes the measurement of the spatial organization of the visual axes of housefly eyes, mapped by an automatic device, using the pseudopupil phenomenon and the pupil mechanism of the photoreceptor cells.

Automatisiertes Charting des visuellen Raums von Stubenfliegen-Facettenaugen

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Sammlung und Langzeitpflege von Blattschneiderameisen (Atta) unter Laborbedingungen

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...