Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grants R01HL089462 SP unterstützt.

1. Kationische Liposomen Vorbereitung <ol><li> Autoklav eine saubere Rundkolben für lipososmes Zubereitung verwendet werden. </li><li> Bereiten Stammlösungen: <ol class="lalpha"><li> - Man löst 200 mg Dimethyl-dioctadecyl Ammoniumbromid (DOAB) in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Lösen Sie 200 mg Cholesterin in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Vorbereitung und Autoklaven auf 5% Glucose in 100 ml RNA / DNA-ase kostenlos destilliertem Wasser zu sterilisieren. </li></ol></li><li> Spülen Sie den Rundkolben mit Chloroform. In 5-10 ml in den Kolben, Wirbel, und lassen Sie es sich für ein paar Minuten. Halten Sie den Kolben mit Aluminiumfolie jederzeit gesichert. Leeren Sie das Chloroform aus dem Kolben. </li><li> Herstellung von Liposomen: <ol class="lalpha"><li> - In 315 ul DOAB Stammlösung der Rundkolben. </li><li> - In 200 ul Cholesterin stock Lösung in den Kolben. </li><li> - Fügen Sie 9,5 ml Chloroform in den Kolben einnd mischen durch schwenken. </li></ol></li><li> Stellen Sie den Rotationsverdampfer bei 37 ° C, 100 Umdrehungen pro Minute (rpm) oder mehr (100-120 rpm). Der Rotationsverdampfer sollte zu einem Wasserstrahlvakuum Steuerung mit einem Saugrohr richtig befestigt angeschlossen werden. </li><li> Schließen Sie das Argon-Gas-Tank und die Rotavapors. </li><li> Bringen Sie den Kolben an die Rotavapors und passen Sie die optimalen Einstellungen vor dem Absenken es im Wasserbad. Öffnen Sie das erste Ventil für den Argon vollständig durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn. Immer öffnen und schließen dieses Ventil zuerst. Das zweite Ventil steuert den Argondruck Einblasen in den Kolben gegeben. Der Druck sollte immer sanft. </li><li> Senken Sie den Rotationsverdampfer im Wasserbad, genug für den Kolben, um das Wasser vollständig untergetaucht, ohne zu berühren, und schalten Sie die Geschwindigkeit. </li><li> Warten Sie, bis alle Chloroform verdunstet, ca. 10 min. Dann die Maschine stoppen. </li><li> Schalten Sie die Geschwindigkeit und die Rotavapors Argontank Ventile. Jetzt wird der Kolben entfernt werden sollte. </li><li> 2 ml 5% Glucose zu the Kolben zu lösen die Lipide. </li><li> Rubbeln Sie an der Unterseite des Kolbens gründlich mit 1 ml Pipettenspitze alle Lipide aufzulösen. Nach Kratzen, entfernen Sie alle verbleibenden Lipid aus der 1 ml-Spitze in den Kolben, wenn nötig, mit einer zweiten Spitze. </li><li> Inkubation der erhaltenen Lösung in 42 ° C Wasserbad während langsam Vortexen (15 rpm) die Flasche. </li><li> Füllen Sie das Ultraschallgerät Bottich mit kaltem Wasser. Beschallen die Lösung für mindestens 20-30 min mit dem Kolben gehalten und der Boden gerade noch das Wasser zu berühren. </li><li> Der Kolben in der Rotavapors die Wasserbad für 20 min bei 42 ° C, bei Drehzahl Null mit rundem Boden in Wasser getaucht, diesmal. </li><li> Filtern Sie die Liposomen durch einen 0,47 Mikron und anschließend 0,22-Mikron-Filter Spritze. </li><li> Mit einem kleinen Extruder, filtern die Liposomen durch einen 50 nm Membran, um eine homogene Population von unilamellaren Liposomen Bläschen zu erzeugen. </li><li> Übertragen Sie die Liposomen zu einem Eppendorf-Röhrchen und legen Sie es auf Eis. </li></ol><html> 2. Bereiten Sie die Liposomen: siRNA-ITSN-1-Komplexe <ol><li> Resuspendieren Sie das On-Target-Maus siRNA ITSN in siRNA-Puffer mit 20 mM HEPES und 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4, auf eine Endkonzentration von 2 pg / pl. Halten Sie es vor dem Mischen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie die Liposomen: siRNA ITSN Komplexe in einem Verhältnis von 8 nmol Liposomen: 2 ug RNA (oder 400 nmol Liposomen: 100 ug siRNA ITSN). In der vorliegenden Studie haben wir 50 ul siRNA ITSN aus der Stammlösung (50 &amp;mgr; M) zu 100 ul frisch zubereitet Liposomen mit einem RNA / DNA-ase kostenlos Eppendorf-Röhrchen. Beachten Sie, dass die Konzentration von siRNA ITSN sehr wichtig ist, weil ein Maximum von 150 ul Mischung bilateral und retroorbitalen injizierten in der Maus sein kann, auf einmal. </li><li> Halten Sie die Mischung auf Eis während der Wartezeit, um die Mäuse zu injizieren. </li></ol> 3. Maus Retro-Orbital-Injektion (Internal Winkel der Augenhöhle) jove_content &quot;&gt; Alle Mausexperimenten genehmigt wurden und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Rush University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt. <ol><li> Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion einer 50 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg / kg Körpergewicht Xylazin (im Handel erhältlich Mischung). Je nach Gewicht des Tieres und das Alter, passen Sie die Lautstärke Anästhetika und Konzentration. Die Mäuse in der Studie verwendeten Mäuse sind CD1 männliche Mäuse, 6-8 Wochen alt und wiegen rund 25 Gramm. Die Spritzen sind Tuberkulin 1 ml Typ mit der Nadel. </li><li> Halten Maus Ohren mit einer Hand und drehen Sie die Maus nach unten auf einer Seite, um die interne Augenwinkel freizulegen. Richten medial der Plica semilunaris; berühren den Augapfel. </li><li> Nähern der Tränenflüssigkeit des Auges caruncle Halten der Spritze, die das Gemisch in einem 45 Grad Winkel in allen drei Achsen. </li><li> Langsam spritzen die Mischung und lassen Sie die Maus, um mit dem injizierten Seite erholen sich. Wenn eine große FlüssigkeitTröpfchen bildet sich an der Nadeleinführung Platz einfahren Nadel-, Saug-back der Tropfen in die Spritze und versuchen Sie es erneut. Wiederholte Injektionen werden am besten durch abwechselnd die Augen getan, um eine perfekte Erholung zu ermöglichen. Wenn Sie unsicher sind, kann diese Technik durch die Injektion von blauem Farbstoff (50 ul, 0,5% Kristallviolett in Methanol) und das Aussetzen der Maus Lunge, um den blauen Gefäßsystem beobachten überprüft werden. </li><li> Die Mäuse wurden in dieser Studie injiziert wird jeden 3. Tag für 3 Wochen ohne Todesfälle oder unerwünschte Nebenwirkungen. </li></ol> 4. Maus Lung Perfusion und Tissue Collection für biochemische Studien <ol start="0"><li> Stellen Sie die Schlauchpumpe auf 1,5 ml / min laufen. </li><li> Bereiten Sie die Einstellung: Ventilator, OP-Tisch, Instrumente, sterile Wattestäbchen, Q-Tips, Strings, Bechern, destilliertes Wasser, Hanks balanced salt, Tracer. </li><li> Anesthetize die Maus durch intraperitoneale Injektion des Narkosemittels Gemisch (100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin). </li&gt; <li> An der Höhe des Halses, entfernen Sie die Speicheldrüsen und setzen die Luftröhre. </li><li> Beginnen Sie mit Bauchschnitt, Verbrauchssteuern das Zwerchfell, und folgen mit Thorakotomie, Aussetzen der Lunge und das Herz. </li><li> Entfernen Sie die Thymus. </li><li> Mit der Lichtmikroskopie für eine bessere Genauigkeit, catheterize die Lungenarterie. </li><li> Haben Tracheotomie und Intubation mit der Maus über das Tracheostoma. Stellen Sie den Ventilator zu einer Geschwindigkeit von 150 Hüben / min und Hubvolumen von 150 ul. </li><li> Als Abgang, öffnen Sie die linke Atrium. </li><li> Perfundieren die Maus Lungengefäße frei von Blut für 5 min, mit der Schlauchpumpe und Hank-Lösung erwärmt auf 37 ° C. </li><li> Perfundieren den Tracer (8 nm Gold-Albumin 16) für weitere 10 min bei der gleichen Fließgeschwindigkeit. </li><li> Spülen Sie die ungebundenen Tracer von 5 min Lungenperfusion mit Hanks-Lösung. </li><li> Folgen Sie mit in situ Fixierung der Lunge, die durch 10 min Perfusion von 4% (wt / vol) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd und 1% Gerbsäure in 0,1 PIPESPuffer, pH 7,2. </li><li> Sammeln Sie die Lungen, entfernen Sie den übermäßigen Gewebe, schneiden kleine Blöcke (3/3 mm), und legen Sie sie in einem markierten Szintillationsfläschchen mit 2 ml Fixativ Mischung. </li></ol> Die Mäuse erlischt vollständig betäubt während des Verfahrens. 5. Maus Lung Gewebeeinbettsystem für EM <ol><li> Bereiten Stammlösungen: 1% OsO 4 Palade, Acetat veronal und Kellenberger Puffer. <ol class="lalpha"><li> - 1% OsO 4 Palade-Puffer enthält: 1 ml Acetat veronal Lager, 1,25 ml 4% OsO 4, 1 ml 0,1 N Salzsäure und destilliertem Wasser bis zu 5 ml Endvolumen. </li><li> - Acetate veronal Lager wird durch Auflösen von 1,15 g Natriumacetat und 2,94 g andydrous Barbital in 100 ml destilliertem Wasser erhalten. </li><li> Kellenberger-Lösung enthält 2 ml Acetat veronal Lager, 2,8 ml 0,1 N Salzsäure, 0,05 g Uranylacetat und 5,1 mldestilliertes Wasser, pH = 6. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Lunge Blöcke in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH = 7,4, 3 mal kurz. </li><li> Befestigen der Proben in die 4% (w / v) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 PIPES-Puffer, pH 7,2, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Mit 1% Palade-Osmium Post-fix für 1 Stunde in der Motorhaube, auf Eis, in der Dunkelheit. </li><li> Spülen Sie einmal mit Puffer Kellenberger. </li><li> Inkubieren Proben in Kellenberger Puffer für 2 h bis über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen einmal in 50% Ethanol. </li><li> Entwässern mit abgestuften Reihe von Ethanol, 5 min / Stück: 70%, 95%, dann 2 x 15 min 100% Ethanol. </li><li> Wechseln Sie zu 100% Propylenoxid, 2 x 15 min. </li><li> Entfernen Sie die Propylenoxid und dann eine Mischung aus 50% Propylenoxid und 50% Epon 812, über Nacht inkubieren, Drehen eines Rades, bei Raumtemperatur. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Mischung und fügen Sie frisches Epon 812, wenigstens für 4-5 Stunden auf dem Rad. </li><li> Mit verdoppelt sich verjüngenden Formen gefülltauf halbem Weg mit frischen 100% Epon 812, fügen ausgewählten Proben und legen Sie sie an den Kanten. </li><li> Bewegen Sie die Formen in den Inkubator auf 60 ° C und lassen Sie sie für 48-72 Stunden aushärten. </li><li> Wenn polymerisiert, senden Sie die Blöcke, dünn zu sein (60-70 nm dick) geschnitten. </li></ol>

<ol>
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Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. 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(432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Basierend auf früheren Studien von anderen 9 und uns 1, 18 haben wir diese Methode für die langfristige knock down von ITSN-1s in vivo durch wiederholte intravenöse Verabreichung (alle 72 h für 24 aufeinanderfolgende Tage) spezifischer siRNA / Liposom-Komplexen veröffentlicht. Dieser experimentelle Ansatz ist effizient, sicher und immer wieder verwendet werden und es kann leicht erweitert werden, um die Beteiligung eines Gens jedes Protein von Interesse in der Lunge und pulmonaler End...

Nackte siRNA kann nicht durch die Zellmembran, das negativ geladen ist, und es ist leicht durch Enzyme abgebaut in Blut, Gewebe und Zellen. Selbst mit kurzem strukturelle Veränderungen, um die Stabilität zu verbessern, ist siRNA Akkumulation am Zielort nach Verabreichung äußerst gering und erfordert eine effiziente intrazelluläre Fahrzeug 5. Kationische Liposomen erwies sich als sicher Nukleinsäuren Träger mit dem Potenzial, große Stücke von DNA / RNA in Zellen übertragen durch Verkapselung und Schutz der Nukleinsäuren vor enzymatischem Abbau 6. Auch kationische Liposomen spontan interagieren mit DNA / RNA, damit die Förderung Gentransfer in die Zellen 2. In jüngerer Zeit Liposomen wurden angewendet, um Impfstoffe und niedrigem Molekulargewicht Drogen 7 liefern. Liposomal Lieferung microRNA-7-exprimierenden Plasmid überwindet epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz in Lungenkrebszellen 8. Bei der Ausrichtung dervaskulären Endothel ist die intravenöse Verabreichung notwendig, weil die Komplexe unwahrscheinlich, dass die endotheliale Schranke und extravasieren in dem Interstitium 9 sind. Im Vergleich zu anderen Organen, ECS vom Mikrovaskulatur der Lunge haben die größte Aufnahme und eifrig verinnerlichen kationische Liposomen und DNA / RNA-Komplexen, die Lymphknoten und Peyer-Plaques 9 gefolgt. Intravenöse Lieferung in Tiermodellen der siRNA über retroorbitalen oder Schwanzvene Injektionen ist erwiesen, auch in hohen Konzentrationen, wie 50 mg / kg 10 harmlos. In der Literatur die Zusammensetzung Liposomen, unterscheidet, basierend auf der Formulierung, Lipide und deren äquimolaren Verhältnis 11, 12. Es gibt eine breite Palette von möglichen Anwendungen, die kationische Liposomen für den Gentransfer in vivo, ob Targeting down-regulation/over-expression der Proteine, die Lieferung von Impfstoffen oder Anti-Tumor-Therapien 13-15. Wichtig zu merkenist, dass die Effizienz der DNA / RNA-Zellmembran Wechselwirkung durch die Form Kopplung zwischen erzeugten Komplexe und Membranlipiden geregelt wird. Dies legt nahe, dass Anpassung der Lipide Zusammensetzung auf die gezielte Zellmembran Profilen von Vorteil sein kann und zu einer hohen Transfektionseffizienz in einem bestimmten Zelltyp 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

Frühere Studien zeigten, dass Knockdown von ITSN-1s (KD ITSN), ein Protein, das in der Regulierung endozytischen Lunge vaskulären Permeabilität und Endothelzellen (ECs) Überleben, induzierte Apoptose, ein wesentliches Hindernis bei der Entwicklung eines Zellkultur-System mit längerer ITSN-1s beteiligt Hemmung 1. Mit kationische Liposomen als Träger, erkundeten wir die Silencing ITSN-1s-Gen in der Maus Lunge durch systemische Verabreichung von siRNA Targeting ITSN-1-Gen (siRNA ITSN). Kationische Liposomen bieten mehrere Vorteile für siRNA Lieferung: Safe mit wiederholter Gabe, nicht immunogen, ungiftig und einfach zu 2 zu erzeugen. Liposomen Leistung und biologische Aktivität von ihrer Größe, Ladung, Lipid-Zusammensetzung, Stabilität, Dosis und Art der Verabreichung 3 Hier eine effiziente und spezifische KD ITSN in Mauslungen wurde unter Verwendung eines Cholesterin-und Dimethyl Dioctadecyl ammoniumbromid Kombination ab. Intravenöse Verabreichungvon siRNA ITSN / kationische Liposomen-Komplexe vorübergehend abgerissen ITSN-1s Protein und mRNA in Mauslungen am Tag 3, die nach weiteren 3 Tagen wiedergefunden. Unter Ausnutzung der kationische Liposomen als wiederholbare sichere Fluggesellschaft, erweitert die Studie für 24 Tage. So wurde retroorbitalen Behandlung mit frisch erzeugten Komplexe verabreicht jeden 3. Tag, induzieren anhaltende KD ITSN während der Studie 4. Maus-Gewebe an mehreren Zeitpunkten nach der siRNA ITSN gesammelt wurden elektronenmikroskopische (EM)-Analysen unterzogen, um die Wirkung einer chronischen KD ITSN auszuwerten, Lunge Endothel. Hochauflösende EM Bildgebung erlaubt es uns, die morphologischen Veränderungen durch KDITSN in der Lunge Gefäßsystem verursacht bewerten (dh Störung der endothelialen Barriere, verringerte Anzahl von Caveolae und Hochregulation alternative Transportwege), Eigenschaften nicht nachweisbar durch Lichtmikroskopie. Insgesamt diese Erkenntnisse etabliert eine wichtigewichtige Rolle von ITSN-1s in der ECs Funktion und Lunge Homöostase, während, die die Wirksamkeit von siRNA-Liposomen Lieferung in vivo.

ITSN-1s Protein-und mRNA-Spiegel wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der siRNA ITSN Lieferung durch Western-Blot-und konventionellen und quantitative PCR, wie in 4 überwacht. ITSN-1s Protein-und mRNA-Level in siRNA-behandelten Maus ITSN Lungen waren etwa 75% niedriger unter Bezugnahme auf die Kontrollen während der kontinuierlichen Knockdown von ITSN-1s für 21 Tage. Ohne ITSN-1s, Dynamin-2 ist ein wichtiger Interaktionspartner von ITSN-1s und wichtiger Akteur in Ablösung von Cav...

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Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Aufrufe.  Rush University. Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Serie: Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Korrelat konfokale und 3D-Elektronenmikroskopie eines spezifischen Sinneszelle

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...