Nous tenons à remercier Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, et Sonia Garcia pour de précieux conseils sur l&#39;amélioration de la procédure d&#39;automatisation de patch-clamp. Nous remercions Rajnish Ranjan pour obtenir des conseils et de l&#39;aide avec la mise en œuvre de logiciels utiles. Ce travail a été financé en partie par le projet de l&#39;UE Synapse et en partie par la Human Frontiers Science Program.

Une. Préparation de l&#39;équipement <ol><li> manipulateurs de commande à partir d&#39;un ordinateur <ol><li> Connectez chaque boîte de contrôleur de micromanipulateur à un ordinateur via les ports série (RS-232). </li><li> Mettre en œuvre les commandes pour le positionnement, l&#39;interrogation et le réglage des paramètres doivent être envoyés via le port série. Problèmes de vitesse et de compatibilité matérielle donnée C / C + + est recommandé que le langage de programmation. </li><li> Normaliser le système des manipulateurs de référence de sorte que le zéro est la position la plus proche possible à l&#39;égard des moteurs et mouvement positif est dirigé loin des moteurs. </li><li> Placez le microscope à sa position centrale 2 mm au-dessus du spécimen plan focal (coordonnées [0, 0, 2000]). </li><li> Magasin, pour chaque manipulateur, les coordonnées locales qui permettent à l&#39;embout d&#39;une pipette à observer dans le centre du champ de vision du microscope. C&#39;est le point de référence initial pour chaque électrode. </li></ol></li><li> Visuapositions des électrodes. Lize Il est très utile d&#39;être en mesure de suivre la position de chaque électrode au cours d&#39;une expérience. Une représentation graphique est la façon la plus intuitive de l&#39;accomplissement de cette. À cette fin, les systèmes de référence de chaque électrode et celle du microscope doit être adaptée. Un moyen simple d&#39;y parvenir est: <ol><li> Amener la pointe d&#39;une électrode au centre du champ de vue. </li><li> Mémoriser la position de chaque axe du manipulateur et chaque axe du microscope. </li><li> Exécuter avec l&#39;axe des x du manipulateur d&#39;un mouvement relativement grand (1 mm). </li><li> Localiser la pointe une fois de plus le déplacement que le microscope. </li><li> Calculer la différence de la position du microscope depuis sa dernière mesurée. Ce sont les saillies du mouvement de l&#39;axe de l&#39;électrode sur les axes du microscope. </li><li> Répéter les étapes 2.3 à 2.5 de l&#39;axes Y et Z du manipulateur d&#39;électrode. Cela permet une matrice de projections sur le microscope axes à déterminer (&lt;strong&gt; Figure 2), aussi appelée matrice de cosinus: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> Inverser cette matrice pour permettre de calculer les déplacements, dans trois dimensions, requises par le manipulateur d&#39;électrode pour atteindre une position donnée dans le microscope système de coordonnées: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> En utilisant le point de référence initial et la matrice de cosinus de déterminer la position de chaque électrode dans le microscope coordonnées. </li><li> Afficher graphiquement, sur la base de coordonnées, la position de chaque électrode à intervalles réguliers le microscope. Nous avons choisi d&#39;utiliser / C + + bibliothèques dessin C (GDI +) pour dessiner les positions d&#39;électrodes toutes les 40 ms. </li><li> Répéter les étapes 1.2.1 - 1.2.7 chaque fois angles manipulateurs sont modifiées, ou si les changements de position de plusieurs millimètres sont nécessaires, par exemple, lorsque le type d&#39;électrode est modifiée. </li></ol></li><li> Activer le stockage de la positions des caractéristiques pertinentes dans le tissu, comme des cellules ou des points de référence anatomiques, en coordonnées microscope. </li><li> Acquérir vidéo et superposer des informations pertinentes. <ol><li> Mécaniquement aligner l&#39;axe des x de déplacement du microscope avec l&#39;axe horizontal de la caméra du microscope. </li><li> Installer sur l&#39;ordinateur un framegrabber avec la vidéo en direct et la capacité de recouvrement et un kit de développement logiciel (SDK). </li><li> Mettre en œuvre l&#39;opération en direct d&#39;affichage vidéo avec le SDK. </li><li> Convertir le microscope système de coordonnées dans le système de référence de la caméra par la traduction et mise à l&#39;échelle appropriée. </li><li> Dessiner les éléments pertinents en coordonnées de la caméra et de recouvrement sur ​​la vidéo de l&#39;image résultante en direct à intervalles réguliers d&#39;environ 40 ms (figure 3). </li></ol></li><li> Amplificateurs de contrôle. <ol><li> Utilisez le logiciel de l&#39;amplificateur pour contrôler les paramètres de l&#39;amplificateur de l&#39;interface. </li></ol></li><li> Control oscilloscopes. <ol><li> Connectez les oscilloscopes à l&#39;ordinateur en utilisant des ports série. </li><li> Déterminer l&#39;échelle de l&#39;oscilloscope, l&#39;accouplement et la résolution temporelle pour les différentes étapes de la procédure de patch-clamp en voltage-clamp (par exemple électrode dans le bain, la formation de joint, configuration cellule entière) et le courant-clamp. </li><li> Envoyer les commandes de réglage de l&#39;oscilloscope appropriées lorsque les commandes de l&#39;amplificateur sont émis à partir de l&#39;interface. </li></ol></li><li> pression de la pipette de contrôle. <ol><li> Assembler un système de contrôle de pression selon la figure 4. <ol><li> Utilisez une alimentation 12 V / 5 V pour alimenter chaque composant électronique appropriée. </li><li> Connecter la sortie d&#39;une pompe à membrane dans le tampon de pression positive (un récipient de 100 ml). </li><li> Connecter l&#39;entrée d&#39;une pompe à membrane dans le tampon de pression négative (un récipient de 100 ml). </li><li> Raccorder le tuyau de support de pipette d&#39;un capteur de pression dans le pressure système de commande et une vanne pneumatique qui se connecte à la chambre de pression principale. </li><li> Relier chacun des tampons de pression pour une vanne reliée à la chambre de pression principale. </li><li> Connectez une vanne entre le compartiment principal de pression et l&#39;atmosphère. </li><li> Connecter un capteur de pression à la chambre de pression principale. </li><li> Connecter un capteur de pression pour chaque tampon. </li><li> Connectez le système de contrôle de pression à une carte d&#39;acquisition de données. </li><li> Connecter chaque capteur de pression à une entrée analogique. </li><li> Connectez chaque soupape à une sortie numérique. </li></ol></li><li> Retirer décalée par rapport à tous les capteurs par l&#39;ouverture de toutes les vannes sauf ceux qui se connectent à des pompes à membrane et en soustrayant la pression mesurée à la pression atmosphérique. </li><li> Mettre en œuvre le contrôle de la pression <ol><li> Définir dans l&#39;interface d&#39;un contrôle pour activer ou de désactiver le contrôle de pression positive pour chaque pipette. </li><li> Définir une pression positive minimale pour la pipettes d&#39;environ 70 mbar. </li><li> Périodiquement (toutes les 0,5 secondes) détecter lorsque la pression dans les pipettes sous le contrôle de pression actif tombe en dessous du seuil fixé. </li><li> Après le franchissement du seuil ouvrir le tampon de pression positive pour le compartiment de pression et ce compartiment vers la pipette en question pendant de brèves périodes (20 ms) jusqu&#39;à ce que la pression dans les pipettes est au dessus du seuil. Fermez toutes les autres vannes. </li><li> De-activer un contrôle supplémentaire de la pression que l&#39;approche finale vers une cellule d&#39;intérêt est lancé. </li></ol></li><li> Appliquer une pression négative pour la formation de joint <ol><li> Fermez tous les robinets et ouvrir la valve négative tampon de pression vers le compartiment de pression et ce compartiment vers la pipette en question pour la durée de l&#39;expérimentateur nécessite en gardant un bouton enfoncé. </li></ol></li></ol></li><li> Centraliser les commandes sur un dispositif d&#39;interface humaine. <ol><li> Connectez un wirele disponible dans le commercess manette au PC. </li><li> Mettre en œuvre une lecture de l&#39;état de la manette. Par exemple, utiliser les bibliothèques DirectX pour C / C + + pour effectuer des lectures toutes les 5 ms. </li><li> Comparer la situation actuelle avec l&#39;état précédent de détecter les boutons ont été pressé, relâché ou maintenue enfoncée depuis dernière étape de temps. </li><li> Assigner des fonctions à chaque bouton de la manette. Un exemple de cette application est représentée sur la Figure 5. </li></ol></li></ol> 2. Patch-clamp procédure <ol><li> Préparer les tranches de cerveau de la région d&#39;intérêt. </li><li> Placer une tranche de cerveau d&#39;intérêt, avec la région d&#39;intérêt au centre de la plage de déplacement du microscope. </li><li> Sélection de cellules <ol><li> Identifier les cellules d&#39;intérêt en naviguant avec le microscope. Mémoriser la position des cellules sur la base du microscope système de coordonnées avec un droit de la souris, cliquez sur l&#39;affichage de la vidéo en direct sur le dessus de la cellule d&#39;intérêt. </li&gt; <li> L&#39;interface graphique permet d&#39;afficher les cellules sélectionnées ainsi que les micropipettes pour une vue d&#39;ensemble et de logiciels mondial va ajouter un marqueur sur la position de la cellule qui sera superposée sur les images. En outre une image de la cellule est capturée pour référence future dans le fichier &#39;portable #. Jpg ». </li></ol></li><li> Attribution des cellules de pipettes <ol><li> Après avoir sélectionné les cellules d&#39;intérêt, qui attribuer pipette enregistre chaque cellule. L&#39;interface graphique fournit des contrôles d&#39;affectation qui devraient être fixées. Visualiser un aperçu de la configuration finale en cochant la case &quot;Afficher les positions finales. </li><li> Sélectionnez chaque pipette pour qui la position finale l on souhaite ou cochez la case «Sélectionner tout». Désactiver l&#39;affichage de la position actuelle pour une meilleure visualisation, si nécessaire. </li></ol></li><li> Préparer les Pipettes <ol><li> Remplir les pipettes (6 - 8 MQ sont généralement mieux si nombreux pipettes sont utilisées) wième solution intracellulaire et les charger dans leurs détenteurs. Placez les headstages dans leurs fixations, mais ne pas les glisser vers l&#39;avant pour éviter de toucher le bain avec la pointe de la pipette. </li><li> Activer le contrôle de la pression positive et sélectionnez toutes les pipettes de s&#39;assurer que les conseils resteront propres. Faites glisser doucement chaque headstage en place. </li></ol></li><li> Localisation des embouts de pipette <ol><li> Placez le microscope à une position centrale avec un accent 3 mm au-dessus de la tranche en appuyant sur le bouton R2 tout en maintenant la touche &#39;A&#39;. Utilisez la position correspondante pour chaque manipulateur stockée dans l&#39;expérience précédente en appuyant sur la touche L2 tout en maintenant le bouton A. Remarque: À ce stade, il devrait y avoir soit une ombre distinctif d&#39;une pipette en vue ou un petit mouvement le long de l&#39;axe de la pipette devrait être suffisant pour l&#39;observer dans la plupart des cas. Compensation pour les légères différences dans la forme de la pipette doit être effectuée manuellement. </li><li> Apportez la pointe de la pipette dans le foyer. Placer l&#39;embout sur le point rouge au centre de l&#39;écran vidéo sans déplacer le microscope (il devrait toujours être en position [0, 0, 2000]). </li><li> Informer le logiciel que la pipette est au centre de l&#39;écran en appuyant sur la touche Z tout en maintenant le bouton C. Après chaque pointe de la pipette se trouve, l&#39;envoyer pipette arrière de sorte que le suivant peut être situé en appuyant sur la touche L1 tout en maintenant le bouton A. </li></ol></li><li> Approcher les cellules <ol><li> Une fois tous les embouts de pipette ont été précisément situé et chaque pipette est attribué à une cellule, positionner automatiquement les pipettes à proximité de leurs cellules respectives. Faites un clic droit dans le centre du groupe de cellules et sélectionnez l&#39;option &quot;Cluster&quot; dans le menu contextuel. Dans la fenêtre des options de cluster qui apparaîtra, sélectionnez toutes les pipettes que vous souhaitez placer en ce moment et cliquez sur «Allez avec toutes les pipettes vérifiés. Répétez cette opération pour chaque groupe de cellules d&#39;intérêt. </li><li> Perform l&#39;approche finale manuellement. La position des pipettes par rapport à des cellules peut être défini différemment, mais est généralement simplement 200 um à une distance à partir de la cellule dans l&#39;axe de la pipette et 200 um ci-dessus dans le sens vertical, ce qui est suffisant pour maintenir la pointe de la pipette à l&#39;extérieur du tissu . Attendez jusqu&#39;à ce que le positionnement des pipettes est terminé et déplacer le microscope vers une pipette en appuyant sur la touche R1 tout en maintenant la touche C. </li><li> Recalibrer chaque position de la pipette en focalisant le microscope sur sa pointe n&#39;importe où dans l&#39;affichage vidéo et en appuyant sur le bouton B tout en maintenant le bouton C. Un quadrillage doit apparaître brièvement indiquant la position identifiée de la pipette. Si la position n&#39;est pas correcte, placer la pointe sur le point central de l&#39;affichage vidéo et appuyez sur la touche Z tout en maintenant la touche C. </li></ol></li><li> Établir la configuration cellule attachée <ol><li> Assurez-vous que la cellule d&#39;intérêt pour la pipette courant est correctementmarqué. Sinon déplacer le microscope pour correspondre à la cellule d&#39;intérêt avec le point rouge central. Sélectionnez la cellule en appuyant sur le bouton Y tout en maintenant la touche C. Appuyez sur le bouton L2 tout en maintenant le bouton C pour positionner la pipette 200 um loin de sa cellule affectée, le microscope se déplace automatiquement à la position correspondante. </li><li> Ajustez la position de la pipette afin qu&#39;il corresponde le point rouge. Réglez le décalage en appuyant sur la touche R1 tout en maintenant le bouton X. pipette </li><li> Activer l&#39;impulsion de test en appuyant sur la touche L1 tout en maintenant le bouton X. approcher lentement la pipette à sa cellule attribué. </li><li> Lors de l&#39;observation de la formation d&#39;une fossette à la surface de la membrane de la cellule appliquer une brève impulsion de pression négative en appuyant sur la touche Y, tout en maintenant la touche Z pour permettre à la pression appliquée pour accéder à la cellule. Un potentiel de maintien de l&#39;ordre de-65mV devrait établie à ce stade en appuyant sur le bouton L2 tout en maintenant la touche X. </li></ol></li><li> Configuration cellule entière<ol><li> Une fois qu&#39;un Giga-joint est formé, pour chaque cellule, commencer la rupture des membranes en appliquant une pression négative. </li></ol></li><li> Effectuer des enregistrements <ol><li> Utilisez le système de stimulation / acquisition pour effectuer vos enregistrements. Appliquer des impulsions ou des trains d&#39;impulsions sur une cellule individuelle à un moment et observer les réponses sur les cellules restantes de la carte la connectivité entre les cellules enregistrées. </li></ol></li><li> Reculer pipettes <ol><li> Une fois les enregistrements terminés, reculer pipettes lentement du tissu par un clic droit sur le bouton radio de table. Sélectionnez «reculer-&gt; Pipettes 500 um &#39;avoir les pipettes reculent à une courte distance le long de leurs axes. Observer la dérive du potentiel des cellules (effacer les conseils en appliquant une certaine pression positive peut aider). </li><li> Pour reculer pipettes tout le chemin du retour, régler la vitesse de positionnement de «Fast» et répétez la même opération mais choisissez l&#39;option &quot;Tous&quot;. Retirez le utiliséepipettes en glissant doucement sur les headstages et dévissant les pipettes des détenteurs. Il est utile pour éviter la torsion des titulaires dans leurs orbites car cela pourrait grandement nuire à la position de la pointe de la pipette. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Une question se pose immédiatement général concernant le taux de réussite de la procédure que nous avons décrit. Pour les taux de réussite élevés préparation est essentielle. Les pipettes doivent avoir des ouvertures de pointe qui sont adéquates pour les cellules des êtres enregistrées. Filtrer la solution intracellulaire pour éviter le colmatage des pipettes est également important. Extrêmement propre, pipettes fraîchement tirées sont une autre exigence. Une distribution binomiale est le modèle le pl...

La capacité d&#39;enregistrer et de stimuler plusieurs sites avec une précision micrométrique est extrêmement utile pour atteindre expérimentalement une meilleure compréhension des systèmes neuronaux. De nombreuses techniques ont été développées à cette fin, mais aucun de permettre la résolution des submillivolt obtenue par la technique du patch-clamp, essentielle pour l&#39;étude de l&#39;activité de sous-seuil et des potentiels post-synaptiques individuels. Ici, nous couvrir le développement d&#39;un système de patch-clamp assistée par ordinateur de douze électrode destinée à la stimulation et l&#39;enregistrement d&#39;un grand nombre de cellules individuelles avec une précision suffisante pour l&#39;étude de la connectivité neuronale simultanément. Bien que de nombreuses autres applications peuvent être conçus pour un tel système, il se prête particulièrement bien à l&#39;étude de la connectivité synaptique étant donné que le nombre de connexions possibles à l&#39;intérieur d&#39;un groupe de neurones croît proportionnellement au carré du nombre de neurones en question. Par conséquent, alors qu&#39;un système à trois électrodes permet de tester l&#39;occurrence d&#39;un maximum de six raccordements et d&#39;enregistrement le plus souvent un seul, l&#39;enregistrement douze neurones permet de tester l&#39;apparition d&#39;un maximum de 132 connexions et en observant fréquemment sur ​​une douzaine (Figure 1). L&#39;observation de dizaines de connexions permet simultanément d&#39;analyser l&#39;organisation de petits réseaux et impliquer des propriétés statistiques de la structure du réseau qui ne peut être sondé sinon 1. En outre, la stimulation précise de nombreuses cellules permet également la quantification de recrutement de cellules post-synaptiques 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

La technique de patch-clamp est aujourd&#39;hui la méthode la plus bien établi pour enregistrer l&#39;activité électrique des neurones individuels ou leurs compartiments sous-cellulaires. Néanmoins, la réalisation d&#39;enregistrements stables, même à partir de cellules individuelles, reste une procédure fastidieuse d&#39;une complexité considérable. Automatisation de nombreuses étapes en collaboration avec l&#39;affichage de l&#39;information efficace peut grandement aider les expérimentateurs à effectuer un plus grand nombre d&#39;enregistrements avec une plus grande fiabilité et en moins de temps. Afin de réaliser des enregistrements à grande échelle, nous avons conclu l&#39;approche la plus efficace est de ne pas automatiser entièrement le processus, mais de simplifier les étapes expérimentales et de réduire les risques d&#39;erreur humaine tout en intégrant efficacement l&#39;expérience de l&#39;expérimentateur et visuel. Avec ces objectifs à l&#39;esprit, nous avons développé un système assisté par ordinateur qui centralise tous les contrôles nécessaires pour une expérience de patch-clamp multi-électrode dans une seule interface, un commercManette sans fil ially disponible, tout en affichant expérience en matière d&#39;information et d&#39;orientation des indices sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur. Nous décrivons ici les différentes composantes du système qui nous a permis de réduire le temps nécessaire pour atteindre la configuration d&#39;enregistrement et d&#39;accroître sensiblement les chances de succès d&#39;enregistrement grand nombre de neurones simultanément.

Après les méthodes décrites ci-dessus nous avons réussi à effectuer un enregistrement à cellules entières jusqu&#39;à douze neurones simultanément, doublant presque le plus grand nombre de neurones simultanément patch-serrée jusqu&#39;à présent. Des exemples de réseaux de connexions synaptiques directes entre les neurones pyramidaux enregistrée dans la couche V du cortex somato-sensoriel chez le rat sont présentés dans la figure 6. La détermination de profi...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l&#39;automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d&#39;accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d&#39;enregistrements.

Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K vues.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l'automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d'accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d'enregistrements. 

Vidéo: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

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Neurosciences

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
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Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

La culture et l&#39;électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation des neurones sensoriels de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.