Biz yama kelepçe prosedür otomasyonu için iyileştirmeler değerli tavsiyeler Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca GAMBAZZI ve Sonia Garcia teşekkür etmek istiyorum. Biz değerli tavsiye ve yazılım uygulama ile yardım için Rajnish Ranjan teşekkür ederim. Bu çalışma, AB Synapse proje ve kısmen İnsan Frontiers Bilim Programı tarafından finanse edildi.

1.. Ekipmanları Hazırlık <ol><li> Bilgisayardan kontrol manipülatörler <ol><li> Seri port (RS-232) üzerinden bir bilgisayara her mikromanipülatördür denetleyici kutusuna bağlayın. </li><li> Sorgulama ve seri port üzerinden gönderilecek ayarlarını, konumlandırma için komutları uygulamak. Verilen hız ve donanım uyumluluk sorunları C / C + + programlama dili olarak tavsiye edilir. </li><li> Sıfır motorlar ve pozitif hareket motorları uzağa yönlendirilir ile ilgili olarak mümkün olan en konumu böylece manipülatörlerin referans sistemini standart hale getirilmiştir. </li><li> 2 mm numune odak düzlemi (koordinatlar [0, 0, 2000]) üzerinde merkezi bir konumda mikroskop yerleştirin. </li><li> Store, her bir manipülatör için, bir pipet ucu mikroskop görüş alanının merkezinde gözlenmesine olanak sağlayacak yerel koordinatlar. Bu her elektrot için ilk referans noktasıdır. </li></ol></li><li> Visualizedirler elektrot konumları. Bu bir deney sırasında her elektrodun pozisyonunu takip edebilmek için çok yararlıdır. Bir grafik gösterimi Bunu sağlamanın en kolay yoludur. Bu amaçla referans her elektrodun sistemleri ve mikroskop eşleşme. Bunu gerçekleştirmek için basit bir yoldur: <ol><li> Görüş alanının merkezine bir elektrot ucu getirin. </li><li> Manipülatör her eksen üzerindeki konumunu ve mikroskop her ekseni saklayın. </li><li> Manipülatör göreceli olarak büyük bir hareket (1 mm) x-ekseni ile çalıştırın. </li><li> Bir kez daha, sadece mikroskop hareketli ucu bulun. </li><li> Geçen ölçüldü yana mikroskop pozisyonda farkı hesaplayın. Bu mikroskop eksenleri üzerine elektrot eksen hareketinin tahminler vardır. </li><li> Y ve elektrot manipülatör Z eksenleri için 2.5 - 2.3 adımları tekrarlayın. Bu mikroskop üzerine çıkıntıların bir matris (&lt;belirlenmelidir eksenlerine izin verirstrong&gt; Şekil 2) de kosinüs matrisi denir: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> Mümkün koordinat sistemi mikroskop belirli bir konuma ulaşmak için elektrot manipülatör tarafından gerekli üç boyutlu olarak hareketleri, hesaplamak için bu matris tersine çevirme: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> Ilk referans noktasını kullanarak ve kosinüs matrisi mikroskopta her elektrodun pozisyonunu belirlemek koordinatları. </li><li> Mikroskop, düzenli aralıklarla, her elektrodun konumu koordinatları göre, grafik olarak gösterir. Biz elektrot konumlarını her 40 msn&#39;den çekmek için C / C + + çizim kütüphaneleri (GDI +) kullanmayı seçti. </li><li> 1.2.7 birkaç milimetre pozisyon değişiklikleri ihtiyaç varsa manipülatör açıları değiştirilebilir veya her seferinde, örneğin, elektrot tipi değiştirildiğinde - tekrarlayın 1.2.1 adımları. </li></ol></li><li> Positio saklamak etkinleştirinBu tür hücreler ya da anatomik referans noktaları olarak dokuda ilgili özelliklerinden ns, mikroskopta koordine eder. </li><li> Videoyu Edinme ve ilgili bilgi bindirmek. <ol><li> Mekanik mikroskop kameranın yatay ekseni ile mikroskop hareket x-ekseni hizalayın. </li><li> Bilgisayarınızda canlı video ve bindirme yeteneği ve bir yazılım geliştirme kiti (SDK) ile bir framegrabber yükleyin. </li><li> SDK ile canlı video görüntüleme işlemi uygulamak. </li><li> Mikroskop uygun çeviri ve pullanma ile kamera referans sistemine koordinat sistemi dönüştürmek. </li><li> Yaklaşık 40 msn (Şekil 3) düzenli aralıklarla canlı video edilen görüntü üzerinde kamera koordinatları ve bindirme olarak ilgili özellikleri çizin. </li></ol></li><li> Kontrol Amplifikatörler. <ol><li> Arayüzünden amplifikatör ayarlarını denetlemek için amplifikatör yazılımını kullanın. </li></ol></li><li> Coosiloskoplarını NTROL. <ol><li> Seri bağlantı noktalarını kullanarak PC&#39;ye bağlayın osiloskoplarını. </li><li> Gerilim-kelepçe de yama kelepçe prosedürünün farklı adımları için osiloskop ölçeği, kavrama ve zamansal çözünürlük belirleyin (örneğin elektrot banyo, mühür oluşumu, tam hücreli konfigürasyonunda) ve akım-kelepçe. </li><li> Amplifikatör komutları arayüzünden her yayımlandığında uygun osiloskop ayarı komutları gönderebilirsiniz. </li></ol></li><li> Kontrol pipet basıncı. <ol><li> Şekil 4&#39;e göre bir basınç kontrol sistemi bir araya getirin. <ol><li> Uygun şekilde her elektronik komponent temini için bir 12 V / 5 V güç kaynağı kullanın. </li><li> Pozitif basınç tampon maddesi (100 mi kabı) için bir membran pompasının çıkışını. </li><li> Negatif basınç tamponu (100 mi kabı) için bir membran pompasının girişi takın. </li><li> Pressu olarak, bir basınç sensörüne pipet tutucusu boru geçkontrol sistemi ve ana basınç bölmesine bağlayan bir pnömatik vana yeniden. </li><li> Ana basınç bölmesine bağlı bir valf için basınç tampon her bağlayın. </li><li> Ana basınç bölmesi ve atmosfer arasında bir valf bağlayın. </li><li> Ana basınç bölmesine bir basınç sensörü bağlayın. </li><li> Her tampon bir basınç sensörü bağlayın. </li><li> Bir veri toplama kuruluna basınç kontrol sistemi bağlayın. </li><li> Bir analog giriş için her basınç sensörü bağlayın. </li><li> Dijital çıkış için her valfini bağlayın. </li></ol></li><li> Membran pompalara bağlayan olanlar dışındaki tüm vanaların açılması ve ölçülen basıncı çıkarılarak tüm sensörlerden ofset atmosferik basınç çıkarın. </li><li> Basıncı kontrolü uygulamak <ol><li> Arayüzünde her pipet için pozitif basınçlı kontrolünü etkinleştirmek veya de-etkinleştirmek için bir denetim tanımlayın. </li><li> Pipet için bir pozitif basınç en az tanımlamayaklaşık 70 mbar&#39;lık s. </li><li> Aktif basınç kontrol altında pipet basınç ayarlanan eşiğin altına düştüğünde periyodik olarak (her 0.5 sn) algılar. </li><li> Eşiği geçtikten sonra pipetler basınç eşiğinin üstünde olana kadar kısa süreli (20 msn) sırasında söz pipet doğru ana basınç bölmesi ve bu bölme için pozitif basınçlı tampon açın. Diğer tüm vanalarını kapatın. </li><li> Ilgi bir hücreye doğru son yaklaşma başlatılan gibi başka basınç kontrolü de etkinleştirebilirsiniz. </li></ol></li><li> Mühür oluşumu için negatif basınç uygulayın <ol><li> Tüm vanaları kapatın ve deneyci basılı bir düğmeye tutarak gerektirir süre için söz konusu pipet doğru ana basınç bölmesi ve bu bölmeye yönelik negatif basınç tampon vanasını açın. </li></ol></li></ol></li><li> Bir insan arabirim aygıt üzerine komutları merkezde. <ol><li> Bir ticari olarak temin edilebilir Kablosuz A geçPC&#39;ye ss gamepad. </li><li> Joystick durumu okunmasını uygulamak. Örneğin, readouts her 5 msn&#39;den gerçekleştirmek için C / C + + için DirectX kütüphaneleri kullanabilirsiniz. </li><li> Düğmeler son kez adım beri, basılı serbest veya basılı tutuldu algılamak için önceki durumu ile şimdiki durumunu karşılaştırın. </li><li> Gamepad her düğmenin fonksiyonları atayın. Bu eşleme bir örneği Şekil 5&#39;te gösterilmektedir. </li></ol></li></ol> 2. Patch-kelepçe Prosedürü <ol><li> Ilgi bölgenin beyin dilimleri hazırlayın. </li><li> Mikroskop yer değiştirme aralığının merkezinde ilgi bölgesi ile, ilgi konusu bir beyin dilim yerleştirin. </li><li> Hücre Seçim <ol><li> Mikroskop ile tarayarak ilgi hücreleri belirlemek. Koordinat sistemi mikroskop göre hücrelerin konumunu kaydedin doğru bir ilgili hücrenin üstüne canlı video ekranında fare tıklaması. </li&gt; <li> Görüntülerde yerleştirilecektir hücre konumundaki bir işaretleyici katacak grafik arayüzü küresel bir bakış ve yazılım için seçilen hücrelerin yanı sıra mikropipetler gösterecektir. Ayrıca hücrenin bir görüntü dosyası &#39;Hücre #. Jpg&#39; İleride referans olması için yakalanır. </li></ol></li><li> Pipetler hücrelerin Attribution <ol><li> Ilgi hücreleri seçtikten sonra, her hücre kaydetmek hangi pipet atayın. Grafik arayüzü ayarlanmış olmalıdır atama kontrolleri sağlar. Checkbox &#39;Show Final Pozisyonlar&#39; seçerek son yapılandırma önizlemesini gözünüzde canlandırın. </li><li> Nihai pozisyon önizleme istenen veya &#39;Tümünü Seç&#39; onay kutusunu olduğu için her pipet seçin. Gerekirse daha iyi görselleştirme için geçerli konum ekranı devre dışı bırakın. </li></ol></li><li> Pipetler hazırlayın <ol><li> (- Birçok pipetler kullanılır ise, 8 MQ genellikle en iyi 6) wi pipetler doldurunhücre içi bir çözüm inci ve onların sahipleri onları yük. Kendi fiksasyonlarında headstages yerleştirin ama pipet ile banyo dokunmamak için ileri kaydırın yok. </li><li> Pozitif basınç denetimini etkinleştirmek ve ipuçları temiz kalmasını sağlamak için tüm pipetler seçin. Yavaşça bir yerde her headstage kaydırın. </li></ol></li><li> Pipet ipuçları bulma <ol><li> 3 mm &#39;A&#39; tuşuna basılı tutarken düğmeye R2 basarak dilim üzerinde odak merkezi bir konuma mikroskop yerleştirin. Düğmesi L2 basarak önceki deney saklanan olarak düğme A tutarken her manipülatör için gelen konumunu kullanın Not: Çoğu durumda bunu gözlemlemek için yeterli olmalıdır Bu noktada görünümünde bir pipet farklı bir gölge ya da Pipet ekseni boyunca küçük bir hareketi ya da olmalıdır. Pipet formda bir miktar farklardan telafisi için el ile yapılması gerekir. </li><li> Odak haline pipet getir. (Hala [0, 0 2000] pozisyonda olmalıdır) mikroskop hareket ettirmeden görüntü ekranın merkezi kırmızı nokta üzerinde ucunu yerleştirin. </li><li> Pipet her pipet ucu bulunduktan sonra düğmesini C. tutarken düğmeye Z basarak ekranın merkezinde bulunan yazılım bilgilendirin, geriye o pipet göndermek böylece düğme A tutarken, tek bir düğmeye basarak L1 bulunabilir aşağıdaki </li></ol></li><li> Hücreleri yaklaşırken <ol><li> Tüm pipet uçları lokalize edilmiş ve her pipet bir hücreye atfedilen sonra, otomatik olarak kendi hücrelerine yakın pipetler yerleştirin. Sadece bir hücre grubunun merkezinde sağ tıklatın ve açılır menüde seçeneği &#39;Küme&#39; seçiniz. , Görünür şu anda konumlandırmak istediğiniz tüm pipetler seçin ve &#39;tüm işaretli pipetler git&#39; tıklayın olacak kümesi seçenekleri penceresinde. Ilgi hücreleri her küme için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Peel ile son yaklaşım rform. Hücrelere göreli pipetler konumu farklı belirtilen ancak genellikle 200 um uzakta doku dışında pipetin ucu tutmak için yeterli olan dikey yönde, pipet ve yukarıda 200 um, en ekseninde hücreden basitçe edilebilir . Pipet konumlandırma bitene kadar bekleyin ve düğme C tutarak düğme R1 basarak bir pipet doğru mikroskop hareket </li><li> Video görüntüsüne herhangi bir yerde bahşiş mikroskop odaklanarak ve düğme C&#39;yi bir kare ızgara tutarken B düğmesine basarak her pipet konumunu yeniden kalibre kısaca pipet tespit konumunu belirten görünmelidir. Pozisyonu doğru değilse düğmesini C. tutarken, video görüntü ve düğmesine basın Z merkezi nokta üzerinde ucu yerleştirin </li></ol></li><li> Hücreye bağlı yapılandırma kurulması <ol><li> Geçerli pipet ilgi hücre doğru olduğunu teyitişaretlenir. Aksi merkezi kırmızı nokta ile ilgi hücre maç için mikroskop taşıyın. Mark pipet uzakta onun atanan hücreden 200 mikron konumlandırmak için C düğmesine tutarken düğmesi C. düğmesine basın L2 tutarken düğmeye Y basarak hücre, mikroskop otomatik olarak ilgili konuma hareket edecektir. </li><li> O kırmızı noktayı eşleşecek şekilde pipet konumunu ayarlayın. Düğmesi X&#39;i tutarak düğme R1 basarak ofset pipet ayarlayın </li><li> Yavaş yavaş atfedilen hücreye pipet yaklaşım düğmesine X&#39;i tutarken düğmeye L1 basarak testi darbesi etkinleştirin. </li><li> Hücre zarı yüzeyi üzerinde bir çukur oluşumunun gözlenmesi üzerine uygulanan basınç hücre ulaşmak için izin düğme Z tutarken düğmesine basarak Y negatif basınç kısa bir darbe uygulamak. Yaklaşık-65mV bir tutma potansiyeli düğme X tutarken düğmeye L2 basarak bu noktada kurulmuş olmalıdır </li></ol></li><li> Tüm hücre konfigürasyonunun<ol><li> Bir Giga-mühür, her bir hücre için oluşturulduktan sonra, negatif basınç uygulanarak zarlar kopmasına başlatın. </li></ol></li><li> Kayıtları gerçekleştirin <ol><li> Kayıtları gerçekleştirmek için stimülasyon / toplama sistemi kullanın. Bir seferde darbeleri veya bir tek hücre üzerindeki bakliyat trenler uygulayın ve kaydedilen hücreler arasında bağlantı haritasına kalan hücrelerin yanıtları gözlemlemek. </li></ol></li><li> Pipetler gerileyeceği <ol><li> Kayıtlar bittikten sonra, Tablo radyo düğmesini sağ tıklayarak dokudan yavaş yavaş çekilmeye pipetler. Pipetler kendi eksenleri boyunca kısa bir mesafe çekilmeye var &#39;gerileyeceği-&gt; Pipetler 500 um&#39; seçeneğini seçin. (Bazı pozitif basınç uygulayarak ipuçları temizleyerek yardımcı olabilir) hücrelerin potansiyeli sürüklenme gözlemlemek. </li><li> Tüm yolu geri pipetler çekilmeye, &#39;Hızlı&#39; olarak konumlandırma hızını ayarlamak ve aynı işlemi tekrarlayın, ancak &#39;tüm&#39; seçeneğini seçin. Kullanılan kaldırmayavaşça headstages dışarı kayar ve sahiplerinden pipetler sökerek pipetler. Bu büyük ölçüde pipet ucu pozisyonu ile etkileşebilir beri yuvalarına sahipleri büküm önlemek için yararlıdır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bir acil soru genellikle biz anlatılan prosedürün başarı oranı ile ilgili ortaya çıkar. Yüksek başarı oranları için hazırlık esastır. Pipetler kaydedilen hücreleri canlılar için yeterli ipucu açıklıklar olmalıdır. Tıkanmış pipetler önlemek için hücre içi çözelti filtre de önemlidir. Son derece temiz, taze çekilmiş pipetler başka bir şartı vardır. Bir binom dağılımı bu konularda nihai verimini nasıl etkilediğini anlamak için kullanılabilecek basit modeldir. Bu% 80 veya gör...

Mikrometre hassasiyet ile birden fazla site kayıt ve teşvik kapasitesi deneysel nöronal sistemlerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için son derece yararlıdır. Bu amaçla birçok teknik geliştirilmiştir ama hiçbiri submillivolt çözünürlük eşik altı aktivitesi ve bireysel postsinaptik potansiyeller çalışmak için gerekli olan patch-clamp tekniği ile elde izin verir. Burada aynı zamanda bir kayıt ve nöronal bağlantı çalışma için yeterli hassasiyetle tek tek hücrelerin bir çok sayıda uyarıcı hedefleyen bir on iki elektrot bilgisayar destekli patch-clamp sisteminin geliştirilmesi kapsar. Diğer birçok uygulama böyle bir sistem için tasarlanmış olsa da, bu nöron grubu içinde mümkün bağlantılarının sayısı, söz konusu durum nöron sayısının karesi ile orantılı olarak büyür verilen sinaptik bağlantı çalışmaya özellikle de çok uygundur. Bu nedenle, üç elektrotlu bir sistem sağlar test ederkenkadar altı bağlantılarının oluşumu ve en sık oniki nöronların kayıt, tek tek kadar kayıt 132 bağlantıların oluşumunu test ve sık sık (Şekil 1) bir düzineden fazla gözlemlemeye olanak sağlar. Bağlantıların onlarca gözlem anda mümkün küçük ağların organizasyonu analiz ve aksi halde 1 problanabilir edilemez ağ yapısının istatistiksel özelliklerini anlaması için yapar. Ayrıca, çok sayıda hücrelerin kesin uyarılması da postsinaptik hücreleri 2 işe kantifizasyonunu.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

Patch-klemp tekniği bireysel nöronlar ya da subselüler bölmelerden elektriksel aktivite kayıt için en köklü yöntemi bugün. Bununla birlikte, kararlı kayıtları elde, hatta tek tek hücrelerden, önemli ölçüde karmaşık bir zaman alıcı bir işlem kalır. Verimli bilgi ekranı ile birlikte birçok adımdan Otomasyon ölçüde daha yüksek güvenilirliği ile kayıtların büyük bir dizi performans ve daha az sürede experimentalists yardımcı olabilir. Büyük ölçekli kayıtları elde etmek için biz en verimli yaklaşım tamamen sürecini otomatik hale ancak deneysel adımları basitleştirmek ve verimli deneycinin deneyim ve görsel geribildirim birleştiren ise insan hatası olasılığını azaltmak değil varmıştır. Akılda bu hedefleri ile biz tek bir arayüzde bir çok elektrot patch-kelepçe deneyde, bir Commerc için gerekli tüm kontrolleri merkezde bilgisayar destekli bir sistem geliştirdiially mevcut kablosuz gamepad, bilgisayar ekranında deney ile ilgili bilgiler ve rehberlik ipuçları göstermeleridir. Burada bize kayıt yapılandırmasını elde etmek için gerekli olan zamanı azaltır ve büyük ölçüde başarılı bir şekilde eş zamanlı olarak nöronların sayıda kayıt şansını artırmak için izin sisteminin farklı bileşenleri tarif eder.

Yukarıda tarif edilen yöntemler izlenerek neredeyse eş zamanlı olarak nöronların en çok patch-kenetlenir ve böylece iki katına kadar, aynı anda en fazla on iki nöron bütün hücre kayıt performans başardı. Sıçanların somatosensory korteks tabaka V kaydedilen piramidal nöronlar arasındaki doğrudan sinaptik bağlantıların ağların örnekleri, Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. , Belirli bir hücre tipi için somatik arası mesafenin bir fonksiyonu olarak...

Watch this Scientific Journal Video about A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System at JoVE.com

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Görüntüleme.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir. 

Video: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial veziküllü Membranların Patch Kelepçe Kayıtlar Sahne&gt; ATPaz veziküllü Hazırlık ve Tekniği

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.