我々は、パッチクランプ手順の自動化のための改善に有益なアドバイスをギラッドシルバーバーグ、ミケーレピニャテッリ、トーマス·K·バーガー、ルカGambazzi、およびソニア·ガルシアに感謝したいと思います。我々は、ソフトウェア実装と、貴重なアドバイスと支援をRajnishランジャンに感謝します。この作品は、EUのシナプスプロジェクトで、一部は人間のフロンティア·サイエンス·プログラムによって部分的に資金を供給された。

1。機器の準備<ol><li> コンピュータからの制御マニピュレータ <ol><li>シリアルポート（RS-232）を介してコンピュータに各マイクロマニピュレータコントローラボックスを接続します。 </li><li>クエリを実行し、シリアルポートを経由して送信されるように設定を調整、位置決めのためのコマンドを実装。指定された速度とハードウェアの互換性の問題は、C / C + +は、プログラミング言語としてお勧めします。 </li><li>ゼロモーターと正の移動はモーターから離れて向けられているに関して最も近い位置になるようにマニピュレータの基準システムを標準化。 </li><li> 2ミリメートルの試料焦点面（座標[0、0、2000]）上記の中央位置に顕微鏡を配置します。 </li><li>各マニピュレータのため、ピペットの先端を顕微鏡の視野の中心に観察できるようにローカル座標を格納する。これは、各電極の初期の基準点である。 </li></ol></li><li> 映像設備リゼ電極位置。これは、実験中に各電極の位置を追跡することができることが非常に便利です。グラフィカルな表現は、これを達成する最も直感的な方法である。そのために、参照、各電極のシステムや顕微鏡のそれを一致させる必要があります。これを実現するための簡単​​な方法は、次のとおりです。 <ol><li>視野の中心に電極の先端を持参してください。 </li><li>マニピュレータの各軸上の位置や顕微鏡の各軸に保管してください。 </li><li>マニピュレータ比較的大きな動き（1ミリメートル）のx軸で実行されます。 </li><li>もう一度だけ顕微鏡を移動先の位置を確認します。 </li><li>それが最後に測定されて以来、顕微鏡位置の違いを計算します。これらは、顕微鏡の軸上に電極軸の動きの投影である。 </li><li> Y電極マニピュレータのZ軸用2.5 - を繰り返して2.3を繰り返します。これは、顕微鏡上に凸のマトリックスが&lt;（決定することが可能と軸強い&gt;図2）また、余弦行列と呼ば： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li>顕微鏡の座標系における所定の位置に到達するための電極マニピュレータによって必要な3つの次元で、動きを計算することを可能にするために、この行列を反転する。 <img alt="式2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li>最初の基準点を使用し、余弦マトリックスは、顕微鏡座標で各電極の位置を決定する。 </li><li>顕微鏡座標に基づいてグラフィック表示、定期的に各電極の位置。我々は、電極位置ごとに40ミリを描画するために、C / C + +の描画ライブラリ（GDI +）を使用することにしました。 </li><li> 1.2.7数ミリメートルの位置変更が必要な場合には、マニピュレータ角度が変更されたりするたびに、例えば、電極の種類が変更された場合 - 繰り返し1.2.1を繰り返す。 </li></ol></li><li> positioを格納可能にするそのような細胞または解剖学的基準点として、組織内の関連する特徴のナノは、顕微鏡座標。 </li><li> ビデオを取得し、関連情報をオーバーレイする。 <ol><li>機械的に顕微鏡カメラの水平軸と顕微鏡の運動のx軸の位置を合わせます。 </li><li>コンピュータ上でライブビデオオーバーレイ機能とソフトウェア開発キット（SDK）にフレームグラバをインストールします。 </li><li> SDKでのライブ映像表示動作を実装します。 </li><li>顕微鏡は適切な翻訳とスケーリングすることで、カメラ基準系に座標系を変換します。 </li><li>約40ミリ秒（ 図3）の一定の間隔で、ライブビデオ、得られる画像上でカメラ座標とオーバーレイに関連する特徴を描く。 </li></ol></li><li> コントロールアンプ。 <ol><li>インターフェイスからアンプの設定を制御するために、アンプのソフトウェアを使用してください。 </li></ol></li><li> COオシロスコープntrol。 <ol><li>シリアルポートを使用してPCにオシロスコープを接続します。 </li><li>電圧クランプにおけるパッチクランプ法の異なるステップのためのオシロスコープのスケール、カップリングと時間分解能を決定する（ 例えば電極風呂、シール形成、細胞全体の構成）と電流クランプ。 </li><li>アンプコマンドは、インターフェイスから発行されるたびに、適切なオシロスコープの設定コマンドを送信します。 </li></ol></li><li> 制御ピペット圧力。 <ol><li> 図4に記載の圧力制御システムを組み立てる。 <ol><li>適切に各電子部品を供給するために12 V / 5 Vの電源を使用してください。 </li><li>正圧バッファー（100ミリリットル容器）に1膜ポンプの出力を接続します。 </li><li>負圧バッファー（100ミリリットル容器）に1膜ポンプの入力を接続します。 </li><li> pressuの圧力センサにピペットホルダチューブを接続する制御システムは、主圧力室に接続する空気圧弁を再。 </li><li>主圧力室に接続されたバルブに圧力バッファのそれぞれを接続します。 </li><li>主圧力室と大気との間の弁を接続してください。 </li><li>主圧力室に圧力センサを接続します。 </li><li>各バッファに圧力センサを接続します。 </li><li>データ収集ボードに圧力制御システムを接続します。 </li><li> 1アナログ入力にそれぞれ圧力センサを接続します。 </li><li>デジタル出力に各バルブを接続します。 </li></ol></li><li>膜ポンプに接続しているものを除くすべてのバルブを開き、測定された圧力を引くことによって、全てのセンサからのオフセット、大気圧を削除します。 </li><li>圧力制御を実施<ol><li>インターフェイスの各ピペット用正圧コントロールを有効にするか非アクティブにするためのコントロールを定義します。 </li><li>ピペットのための最小限の正圧を定義する約70ミリバールのS。 </li><li>アクティブな圧力制御の下でピペット内の圧力が設定されたしきい値を下回ったときはいつでも、定期的（0.5秒おき）が検出。 </li><li>しきい値超過時にピペット内の圧力が閾値を超えるまで短時間（20秒）の間、問題になっているピペットに向けた主圧力室と、このコンパートメントに正の圧力バッファを開く。他のすべてのバルブを閉じてください。 </li><li>目的の細胞に向けた最終的なアプローチが開始されるように、さらに圧力制御を非アクティブに。 </li></ol></li><li>シール形成のための負圧を適用する<ol><li>すべてのバルブを閉じて、実験者が押したボタンを保つことによって必要とする間、問題になっているピペットに向けた主圧力室と、この区画に向かって負圧バッファバルブを開きます。 </li></ol></li></ol></li><li> ヒューマンインターフェイスデバイスにコマンドを一元化。 <ol><li>市販のwireleを接続PCへのSSのゲームパッド。 </li><li>ジョイスティックの状態の読み出しを実現する。例えば、読み出しごとに5ミリ秒を実行するために、C / C + +用のDirectXのライブラリを使用しています。 </li><li>ボタンは、最後のタイムステップ以降、押された放出されたか、押し続けるされているを検出するために、以前の状態と現在の状態を比較してください。 </li><li>ゲームパッドの各ボタンに機能を割り当てる。このマッピングの一例が図5に示されている。 </li></ol></li></ol> 2。パッチクランプ手順<ol><li> 関心領域の脳スライスを準備します。 </li><li> 顕微鏡の変位範囲の中央の関心領域で、関心のある脳のスライスを配置します。 </li><li> 細胞選択 <ol><li>顕微鏡で閲覧することで目的の細胞を識別します。目的の細胞の上にライブビデオディスプレイ上でマウスの右クリックで座標系を顕微鏡に基づいてセルの位置を格納します。 </li&gt; <li>グラフィカルインターフェイスは、選択したセルを表示しますだけでなく、世界的な概要と、ソフトウェアのためのマイクロピペットは、画像上にオーバーレイされるセルの位置にマーカーを追加します。さらに細胞の画像をファイルに将来の参照のために捕獲されている「セル＃。JPG」。 </li></ol></li><li> ピペットに対する細胞の帰属 <ol><li>目的の細胞を選択した後、各セルを記録しているピペット割り当てる。グラフィカルインターフェイスを設定する必要があり、割り当てのコントロールが用意されています。チェックボックス「最終位置を表示」を選択することで、最終的な設定のプレビューを視覚化する。 </li><li>最終的な位置のプレビューが望まれる各ピペットを選択するか、「すべて選択」チェックボックスをオンにします。必要に応じて、より良い視覚化のために現在位置表示を無効にします。 </li></ol></li><li> ピペットを準備します <ol><li> （ - 多くのピペットが使用されている場合、8MΩのが最善である6）はウィスコンシンピペットを埋める細胞内液番目とその所有者にロードします。彼らの凝視にヘッドステージを置きますが、ピペットチップと一緒にお風呂に触れないようにするために前方にスライドさせないでください。 </li><li>ヒントはきれいに残っていることを保証するために、正の圧力制御を有効にし、すべてのピペットを選択します。静かに所定の位置にそれぞれのヘッドステージにスライドさせます。 </li></ol></li><li> ピペットチップを配置する <ol><li> 3ミリメートル「A」ボタンを押しながらボタンR2を押してスライス上を中心とした中央の位置に顕微鏡を配置します。ボタンAを押しながらボタンL2を押して、前の実験から保存されている各マニピュレータのための対応する位置を使用 注意：ほとんどの場合、それを観察するのに十分でなければならないこの時点でビュー内のピペットの特徴的な影やピペットの軸に沿った小さな動きのどちらかがあるはずです。ピペット形状のわずかな違いのための補償を手動で実行する必要があります。 </li><li>焦点にピペットチップを持って来る。 （それはまだ[2000、0、0]の位置にする必要があります）顕微鏡を移動することなく、ビデオ表示の赤い中央点で先端を置きます。 </li><li>以下は、いずれかのボタンAを保持しつつボタンL1を押して配置することができるように、後方にそのピペットを送信し、ピペットは、各ピペットチップが配置された後、ボタンCを保持しつつボタンZを押して表示の中心にあるソ​​フトウェアに通知する</li></ol></li><li> 細胞へのアプローチ <ol><li>すべてのピペットチップを正確に配置され、それぞれのピペットがセルに帰属されると、自動的にそれぞれの細胞に近いピペットを配置。単に細胞群の中心に右クリックし、ポップアップメニューのオプション「クラスター」を選択します。表示され、このときの位置するすべてのピペットを選択し、「すべてのチェックをピペットで行く」をクリックするクラスタオプションウィンドウで。目的の細胞を各クラスタに対してこの操作を繰り返します。 </li><li>ペー手動で、最終的なアプローチをrform。細胞に比べてピペットの位置が異なって指定されたが、通常200ミクロン離れてピペットの軸における細胞·組織外のピペットの先端部を維持するのに十分であり、垂直方向のその上の200ミクロンから単純にすることができます。ピペットの位置決めが終了するまで待ってから、ボタンCを押しながら、ボタン、R1を押すことにより、ピペットの方に顕微鏡を移動</li><li>ビデオ·ディスプレイの任意の場所で、その先端に顕微鏡の焦点を合わせると、ボタンCを正方格子を押しながらBボタンを押すと、各ピペットの位置を再調整することは簡単にピペットの識別された位置を示す表示されます。位置が正しくない場合は、ボタンCを押しながら、中央のビデオ·ディスプレイのドットと押しボタンZ上のチップを配置</li></ol></li><li> セル接続構成を確立 <ol><li>現在のピペットのための目的の細胞が正常になっていることを確認マークされた。そうでない場合は、中央の赤い点を目的の細胞に一致するように顕微鏡を移動します。マーク·ピペット離れて、割り当てられたセルから200程度を配置するボタンCを押しながらボタンでボタンを押し、L2を押しながらボタンYを押して、細胞を顕微鏡で自動的に対応する位置まで移動します。 </li><li>それは赤い点に一致するようにピペットの位置を調整します。ボタンXを押しながらボタン、R1を押して、オフセットピペットを調整</li><li>ゆっくりと帰属のセルに、ピペットにアプローチボタンXを押しながらボタンL1を押して、テストパルスをアクティブにします。 </li><li>細胞膜の表面にディンプルの形成を観察する際に加わる圧力は、細胞に到達できるようにするには、ボタンを押しながらZ Yボタンを押すことによって、負圧の短いパルスを印加する。会社概要 - 65mVの保持電位は、ボタンXを押しながらボタンL2を押すと、この時点で確立されなければならない</li></ol></li><li> 全細胞構成<ol><li>ギガシールは、セル毎に形成されると、負圧を適用することによって、膜を破裂開始。 </li></ol></li><li> 録音を行う <ol><li>録音を行うために刺激/収集システムを使用してください。一度に1個々のセル上のパルスのパルスや電車を適用し、記録されたセル間の接続性をマップするために、残りの細胞に応答を観察します。 </li></ol></li><li> ピペットを後退 <ol><li>記録が終了したら、表のラジオボタンを右クリックして、組織からゆっくりとピペットを後退。ピペットは、その軸に沿って短い距離を後退持つように &#39;後退 - &gt;ピペット500程度」を選択します。 （いくつかの肯定的な圧力を加えることによってヒントをクリア助けるかもしれない）細胞の電位のドリフトを観察します。 </li><li>すべての帰りピペットを後退する、「速い」に位置決め速度を設定し、同じ操作を繰り返しますが、「すべて」オプションを選択します。使用を削除静かにヘッドステージをスライドさせてホルダーからピペットを回して外すとピペット。これは大幅にピペットチップ位置に干渉する可能性があるため、ソケットにホルダーをねじれを避けるために役立ちます。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

即時の質問は、通常我々が説明した手順の成功率に関する生じる。高い成功率のための準備が不可欠です。ピペットは、記録された細胞の人間のために適切である先端開口部を持っている必要があります。詰まっピペットを避けるために、細胞内液をろ過することも重要です。非常にきれいで、新鮮に引っ張っピペットは別の要件である。二項分布は、これらの問題は、最終的な収量にどの?...

マイクロメートルの精度で複数のサイトを記録し、刺激する能力は、実験的にニューロン系のより良い理解を達成するために極めて有用である。多くの技術がこの目的のために開発されてきたが、いずれも閾値下の活性および個々のシナプス後電位を研究するための必須のパッチクランプ技術によって達成さsubmillivolt分解能を、許可しない。ここでは、同時に記録し、神経の接続性の研究のために十分な精度で個々の細胞の大多数を刺激することを目的とした十二極コンピュータ支援パッチクランプシステムの開発を覆う。多くの他の用途は、このようなシステムのために考えられるが、ニューロンのグループ内の可能な接続の数は、問題のニューロンの数の二乗に比例して成長することを考えるとシナプス接続の研究に特によく適している。したがって、三つの電極を備えたシステムは、テストを可能にしながら、最大6つの接続が発生すると、ほとんどの場合、12ニューロンを記録し、単一の1を記録するには、最大132の接続が発生することをテストして、頻繁にします（ 図1）1ダース以上を観測することができます。接続の数十の観察は、同時に小規模ネットワークの構成を分析し、そうでなければ1をプローブすることができないネットワーク構造の統計的特性を推測することができる。また、数々の細胞の正確な刺激はまたシナプス後細胞2の募集の定量化を可能にする。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

パッチクランプ技術は、個々のニューロンまたはそれらの細胞内区画からの電気的活動を記録するための最もよく確立された方法今日。それにもかかわらず、安定した記録を実現し、さらには個々の細胞から、かなりの複雑さの時間のかかる手順のままである。効率的な情報の表示に関連して多くのステップの自動化が大幅に高い信頼性で録音のより多くを実行する際にし、短い時間で実験研究を支援することができます。大規模な記録を達成するために、我々は、最も効率的なアプローチは、プロセスを完全に自動化することなく、効率的に実験者の経験と視覚的なフィードバックを取り入れながら実験工程を簡素化し、ヒューマンエラーの可能性を低減することはないと結論付けた。念頭に置いてこれらの目標によって私達は、commercを単一のインターフェースでの多電極パッチクランプ実験のために必要なすべてのコントロールを集中コンピュータ支援システムを開発コンピュータの画面上での実験に関連する情報や指導の手がかりを表示しながら、ially利用可能なワイヤレスゲームパッド。ここでは、私たちは、記録設定を達成するために必要な時間を短縮し、実質的に正常に同時に多数のニューロンを記録する機会を増加させ、システムの異なる構成要素を記載している。

上記の方法に従って、我々はほぼ同時に神経細胞の数が最も多いパッチクランプ、これまでに倍増、同時に最大12のニューロンの細胞全体の記録を行うことに成功しました。ラットの体性感覚皮質のV層に記録された錐体細胞間の直接的なシナプス結合のネットワークの例を図6に示す。 所与の細胞型のための体間の距離の関数として接続確率プロファイルの?...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

多電極パッチクランプ記録は、複雑なタスクを構成する。ここでは、実験的な手順の多くを自動化することによって、それがパフォーマンスと録音の数の質的向上につながるプロセスを加速することが可能であるか、を示します。

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K ビュー.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne. 多電極パッチクランプ記録は、複雑なタスクを構成する。ここでは、実験的な手順の多くを自動化することによって、それがパフォーマンスと録音の数の質的向上につながるプロセスを加速することが可能であるか、を示します。 

ビデオ: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

神経科学

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub亜ミトコンドリアの小胞膜のパッチクランプ記録を実行するための&gt; ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.