Die Autoren danken der Wake Forest Institut für Regenerative Medizin für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken für die Unterstützung durch Zuschüsse aus dem Great Ormond Street Hospital Nächstenliebe, die Stiftung Eugenio Litta (Genf, Schweiz), das Medical Research Council, dem Royal College of Surgeons of England, die Funken für Kinderheilnächstenliebe, des britischen Außenministeriums für die UK / USA Stammzell Collaboration Award und dem Forschungsfonds Mittal. Wir möchten auch, um die Royal Society / Wolfson-Stiftung für die für die Kinderchirurgie-Abteilung im Institut der Kind-Gesundheit erhalten Tissue Engineering Labor Sanierung Zuschuss danken. PDC und SE werden von der Great Ormond Street Hospital Kinderhilfswerk unterstützt.

1. Isolierung von Ratten-Darm <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus 1 L Phosphate Buffered Saline (Sigma, UK) mit 1% Antibiotikum / Antimykotikum (Sigma, UK) (PBS / AA). Setzen Sie die Schlauchpumpe (Masterflex L / S mit variabler Geschwindigkeit) mit zwei Röhren. Laufen 70% Ethanol (EtOH) durch die Rohre der peristaltischen Pumpe für 15 min bei maximaler Geschwindigkeit, gefolgt von PBS / AA für weitere 15 min. </li><li> Euthanize erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von ca. 250 bis 350 g CO 2 durch Einatmen und Genickbruch in Übereinstimmung mit den örtlichen Tier Richtlinien und Zulassungen (in Großbritannien, Home Office Leitlinien unter den Animals (Scientific Procedures) Act 1986). </li><li> Autoklaven werden die chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch. Spray und wischen Sie den Bauch des Tieres mit 70% EtOH. </li><li> Führen Sie eine xifo-Scham laparotomic Einschnitt auf dem Bauch, um eine klare OP-Feld zu gewährleisten. </li><li> Ausweiden des Dünndarms auf der rechten Seite des Tieres auf ein Papiertuch mit 70% EtOH besprüht. Take darauf, den Darm mit PBS / AA kontinuierlich zu benetzen, so daß die Dehydratisierung des Gewebes und Denaturierung der extrazellulären Matrix (ECM) zu vermeiden. </li><li> Finde die Arteria mesenterica superior (SMA), die sich in einem Winkel von 90 ° von der Aorta zu den Darm. Verwenden Sie eine 27 G Kanüle, um die SMA aus der Aorta geben und schnell die Nadel zurückziehen, um nicht zu zerreißen die Wand des Gefäßes. Schieben Sie die Kunststoffrohr der Kanüle in der SMA und sichern mit Nähten (Vicryl 5/0). </li><li> Kanülierung bestätigen durch die Injektion von 1 ml PBS / AA. Verwenden Feder Schere, um die Aorta proximal und distal zu dem SMA einzuschneiden, so daß die Kanüle freizugeben. </li><li> Leckage von Fäkalien zu verhindern, wenn die Zerlegung Dickdarm auftreten, legen (Seide 5/0) Nahtknoten auf dem proximalen Ende des ileocaecal-Übergang und einer an dem distalen Ende des Sigmas. Dann schneiden Sie die terminalen Ileum und Dickdarm zwischen den beiden Knoten und entfernen den Dickdarm. </li><li> Schneiden Sie den Darm an der jejuno-Zwölffingerdarm-Kreuzung einnd befreien den Darm von allen Bindegewebe es Verbindungen mit dem Bauch haben könnte. </li><li> Übertragen Sie den Dünndarm in einer Petrischale mit PBS / AA. Kanülieren den proximalen Darmabschnitt mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette (LSL Laborverbrauchsmaterialien) und befestigen Sie sie mit Nähten. Schneiden Sie die Pipette, damit es die Luer-Lok einer 60-ml-Spritze (BD Plastikpak) passen. Spülen Sie das Darmlumen 2x mit 60 ml PBS / AA Kot und Schmutz zu entfernen. </li></ol> 2. Dezellularisierung Methodik <ol><li> Verbinden des Gefäßkanüle nach einem Drei-Wege-Hahn. Dies wird Handhabung zu erleichtern, Spannung auf dem Gefäßbaum zu minimieren und Entfernung von Luftblasen aus dem Schlauch. </li><li> Start läuft VE-Wasser (Widerstand 18,2 MOhm / cm) durch die Masterflex L / S mit variabler Geschwindigkeit Rollenpumpe bei 0,6 ml / h. Achten Sie darauf, keine Blasen im Schlauch vor dem Verbinden mit dem Darmlumen Hahn vorhanden sind. Einige Blasen können im Lumen von Schritt vorhanden sein1.9, die die Dezellularisierung Prozess beeinträchtigen können. Variieren der Geschwindigkeit der Pumpe und der Griff des Gewebes mit einer Pinzette vorsichtig, um die Blasen Ausgang von dem distalen Ende zu gewährleisten. Den Kreislauf-Kanüle an, solange dieser Prozess abgeschlossen ist, da hohe Drehzahlen können die Gefäßbaum zu beschädigen. </li><li> Übertragungsvorrichtung in den Kühlraum, da der nachfolgende Schritt der Dezellularisierung wird bei 4 ° C durchgeführt wird Die niedrige Temperatur erlaubt die Entfernung von Zellen, Gewebe, während Zersetzung zu minimieren. Legen Sie die Petrischale in einem Container, der die überquell Lösung sammeln. Perfusion sowohl das Darmlumen und Gefäßbaumes mit entionisiertem Wasser (spezifischer Widerstand 18,2 M &amp;OHgr; / cm) für 24 Stunden bei 0,6 ml / Std. Für die erste Stunde überprüfen das Gerät regelmäßig, um sicherzustellen, dass alle Verbindungen sicher sind, ist Leckage minimal und keine Luftblasen im Darm vorhanden sind. </li><li> Nach 24 Stunden der Behandlung mit VE-Wasser, bewegen Dezellularisierung Gerät außerhalb des Kühlraums wie der Rest der die Schritte sindin Raumtemperatur (RT) durchgeführt. </li><li> Wiegen Natriumdeoxycholat (Sigma, UK) zu 300 ml einer 4% igen Lösung in VE-Wasser vorzubereiten. Wiegen Natriumdeoxycholat unter einer Abzugshaube, da es eine mündliche und Augenreizstoff. Mischen Sie mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Die Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 Monat aufrechterhalten werden. </li><li> Ändern Sie den VE-Lösung Natriumdeoxycholat, überprüfen Sie die Verbindungen, entfernen Sie alle Blasen und Perfusion bei 0,6 ml / h für 4 Stunden. </li><li> Nach dem Natriumdesoxycholat Waschschritt mit PBS / AA für 30 min, um die Interaktion zwischen dem Natriumdesoxycholat und DNase-I zu vermeiden. </li><li> Wiegen Sie Desoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) und bereiten 250 ml einer 2.000 kU Lösung in 1 M Natriumchlorid, pH 7,4. Mischen Sie mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Diese Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden und können nicht gespeichert werden. </li><li> Perfusion mit DNase-I für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,6 ml / Std. </li><li> Nach der DNase-I-Stufe, die übertragenGerüst in einer Gewebekultur Kapuze und ändern Platten und Instrumente. Es wird vorgeschlagen, aseptisch. </li><li> Waschen mit PBS / AA 30 min zu gewährleisten, dass alle Reste der Dezellularisierung Lösungen entfernt werden. Legen Sie das Gerüst in eine neue Petrischale übertragen und mit einer UV-Crosslinker (Spectroline, US). Führen Sie zwei Sterilisationszyklen. Bewahren Sie in 5% PBS / AA und ändern Sie die Lösung alle 3 Tage. </li></ol>

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Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li><li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+a+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li><li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. 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E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+lung+engineering.">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).</li><li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration.">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li><li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die schwierigsten Schritte bei der Einrichtung dieses Experiment beinhalten die Kanülierung der SMA und die Errichtung und Wartung von Sterilität. Kanülierung des SMA bei Nagern ohne Zerreißen der Wand kann ziemlich schwierig aufgrund der Größe und Position des Schiffes sein. Alternativ kann ein Nahtmaterial um den proximalen Aorta vor der SMA Herkunft angeordnet werden, gefolgt durch Kanülierung der Aorta selbst distal Leiten des Kunststoffkanüle in die SMA. Während Dezellularisierung eine Kombination von schlechter Kanüle Platzierung und hohe Durchflussraten in den Gefäßzugang zu verlieren, führen. Sterilität ist ein großes Problem wegen der Menge der im Dünndarm vorhanden Bakterienflora. Waschen mit PBS / AA nach der Ernte ist sehr wichtig, und jedes Zeichen von Fäkalien oder Verunreinigungen müssen aus dem Hohlraum entfernt werden. Anordnen eines Teils des Gerüstes in ein Falcon-Röhrchen mit DMEM in den Inkubator nach UV-Sterilisation sollte ein Indikator sein, wenn Sterilität erreicht. Im Falleder bakteriellen Besiedlung, wird die Medien den pH-Wert mit seiner Farbe Drehen von rot nach gelb ändern. Um damit umzugehen, sind weitere UV-Zyklen, wie gut beraten wie Waschen mit PBS, das eine hohe Konzentration an Antibiotikum / Antimykotikum. Eine mögliche Änderung an ein Gerüst sowohl mit Gefäß-und Venenzugang zu erhalten, wäre es, die untere Hohlvene (IVC) sowie die SMA kanülieren. Dezellularisierung aus den Venen-und Gefäß Seiten sollten intermittierend für alle drei Lösungen versucht. Kontinuierliche Dezellularisierung können die Kapillaren mit positiven Druck auf beiden Seiten platzen. Im Laufe der Jahre gab es zahlreiche Versuche im Darm TE unter Verwendung verschiedener Zellgerüst-Kombinationen in vitro und in vivo 6,9,12. Der Großteil der Arbeit wurde durchgeführt unter Verwendung von rohrförmigen Vliesstoff 95% PGA-5% PLGA Gerüste mit Kollagen Typ I beschichteten 6,7,13,22. Nach der Aussaat mit DarmEpithelzellen organoiden Einheiten (OU) und eine Periode der Implantation in das Netz von Mäusen, Zysten bilden sie mit Muskel auf der Außenseite und Epithel auf der Innenseite der dann tubularized werden können. Allerdings ist die Porosität und die Einfachheit in der Konstruktion dieser Gerüste ermöglicht nicht für die Erzeugung von großen Stücken von Kunstdarm in einem in vitro-Umgebung wie der eines Bioreaktors. Zusätzlich kann das Fehlen einer angeborenen Gefäßnetz, die an den Empfänger weiter verbunden werden können, begrenzt die Verwendung dieses Gerüst für klinische Übersetzung. Neben den Versuchen mit den PGA-PLGA Gerüste haben andere Gruppen SIS Kollagen oder Gerüste, die beide nicht die Komplexität des Darmtrakts verwendet replizieren. SIS ist vor allem der bisher einzigen veröffentlichten Methodik der Darmgewebetechnik und hat in mehr als 150 medizinischen Einrichtungen eingesetzt worden, was die Fähigkeit der dezellularisiertes Gerüste auf mechanische Stabilität und fördern das Zellwachstum, während Bleiten zu keiner Immunreaktion. Doch der Mangel an passenden Makro-und Mikro-Architektur, hat schlechte Ergebnisse in ihrem &quot;Einsatz für die Darm TE Zwecke 9-11,23 geführt. Die Vorteile der Dezellularisierung Methodik, die wir beschrieben haben, gehören die Erhaltung der mikroskopischen Eigenschaften wie der Lumen Krypta-Zotten-Architektur, die ein geeignetes Umfeld für die Wiederbevölkerung repräsentieren durch die Darmstammzellnische. Im makroskopischen Aspekt wird das Vorhandensein eines hierarchischen Gefäßnetz ermöglichen die Befestigung an den Empfänger, so dass Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff zu allen Schicht des TE 21-Darm. Darüber hinaus hat die Aufrechterhaltung der ECM-Komponenten wie Kollagen, Elastin und glyocosaminoglycans eine wichtige Rolle nicht nur mechanische Eigenschaften, sondern auch die zelluläre Proliferation und Differenzierung lenken. Am wichtigsten ist, die Fähigkeit der Dezellularisierung Methodik in große skaliertr Gewebe unter Beibehaltung der gleichen Eigenschaften ist ein wichtiges Merkmal für die klinische Umsetzung von TE. Die Entwicklung eines natürlichen Darmmatrix mit einer Gefäßnetz ermöglicht die Erstellung von größeren Segmente der künstlichen Darm, die mit dem Host verbunden werden.

Tissue Engineering (TE) bietet eine therapeutische Alternative zur Organtransplantation, unter Umgehung Fragen der Immunsuppression und Organknappheit. TE hat vor kurzem erfolgreiche Anwendungen in der Klinik, mit dem Austausch von Organen wie der Blase 1, 2 Harnröhre und der Luftröhre, sowohl bei Erwachsenen und Kindern 5 3,4. Aufbau einer Tissue-Engineering Organ erfordert die Kombination aus einem Gerüst mit den entsprechenden Zellen. Ein Gerüst kann unter Verwendung von natürlich-abgeleiteten (z. B. Kollagen) hergestellt werden, und synthetische (z. B. Poly-L-Glykolsäure; PLGA)-Materialien oder durch die Dezellularisierung von nativem Gewebe und Organen erhalten werden. Gerüste, die bisher für die Darm TE verwendet wurden, waren hauptsächlich entweder dezellularisierte (Dünndarm-Submukosa) oder synthetischen (Poly-L-Glykolsäure und Poly-Milchsäure) 6-13. Diese Biomaterialien sind sehr einfach sowohl in der Makro-und Mikro-Architektur, diemöglicherweise nicht ideal sein, wenn Gewebezüchtung Darm ist klinisch übersetzt werden. Eine optimale Biomaterial für den Darm sollte eine angeborene Gefäßbaum, die der Host-Blutversorgung, einer abgestuften Rohrwand mit unterschiedlichen Eigenschaften, die Schichten der Darmwand zu reflektieren und einer Zotten-crypt-Achse auf der luminalen Seite verbunden werden können, um mit Hilfe haben Wiederbesiedlung von epithelialen Stammzellen. Dezellularisierung ist eine neuartige Methode, die Gerüste produziert, indem sie Zellen aus Voll Organe unter Wahrung ihrer ursprünglichen Architektur 14. Dies ist bevorzugt, um bereits bestehende Gerüste, da sie nicht nur die Struktur des Organs zu replizieren, sondern auch enthalten chemische Signale in der extrazellulären Matrix (ECM), dass die Hilfe zelluläre Proliferation und Differenzierung eingebettet. Im Jahr 2008 wurde ein Leichenluftröhre dezellularisiert 14, mit patienteneigenen Zellen besiedelt und transplantiert werden, um die wichtigsten linken Bronchus bei einem jungen Mann zu ersetzen <sup&gt; 3. Seitdem haben eine Reihe von Gruppen die Produktion von dezellularisiertes Gerüste für das Herz 15, Leber 16,17 und Lunge 18-20 in kleinen und großen Tieren berichtet. Wir haben auch die gleiche Methode, um eine kleine Darm dezellularisiertes Gerüst 21 produzieren angepasst. Das Ziel der hierin beschriebenen Verfahren ist die dezellularisierte Darm Matrizen, die die makroskopischen Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, wie die Blutzufuhr als auch die mikroskopische Architektur der Zotten-Kryptenachse im Darmlumen aufrechtzuerhalten erzeugen. Wir glauben, dass diese Methode könnte letztlich für andere Organe angenommen, um die Effizienz der Dezellularisierung verbessern.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

Erfolgreicher Gewebetechnik beinhaltet die Kombination von Gerüsten mit den entsprechenden Zellen in vitro oder in vivo. Gerüste können synthetisch, natürlich gewonnenen oder aus Geweben / Organen abgeleitet ist. Letztere werden unter Verwendung einer Technik, die Dezellularisierung erhalten. Dezellularisierung kann es sich um eine Kombination von physikalischen, chemischen und enzymatischen Methoden. Das Ziel dieser Technik ist es, alle zellulären Spuren unter Beibehaltung der Makro-und Mikroarchitektur des ursprünglichen Gewebes zu entfernen. Darmgewebetechnik bisher verwendeten relativ einfache Gerüste, die die komplexe Architektur der nativen Organ nicht replizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist es, eine effiziente Technik zur Dezellularisierung Rattendünndarms zu beschreiben. Die Isolierung des Dünndarms, um die Aufrechterhaltung einer Gefäßverbindung sicherzustellen beschrieben. Die Kombination von chemischen und enzymatischen Lösungen, um die Zellen zu entfernen whilst Erhaltung der Zotten-crypt-Achse in der luminalen Aspekt des Gerüsts wird auch eingestellt. Schließlich Beurteilung der hergestellten Gerüste für entsprechende Eigenschaften wird diskutiert.

Nach erfolgreicher Dezellularisierung (Fig. 1) ist das Gerüst eine makroskopische Aussehen ähnlich dem des nativen Darm, aber mit durchlässige Wände (2A). Die Erhaltung der Makro-Architektur sollte auch klar sein, von der Durchgängigkeit der Gefäßbaum. Wenn Farbstoff wird durch die Kanüle injiziert SMA sollte gleichmäßig im Gerüst verteilt und erreichen die kapillare Struktur (2B). Das Gerüst sollte frei von Kern-und Zytoplasma-Material, etwas, das mit Hilfe eines DNA-Quantifizierung Kit und einfache histologische Analyse beurteilt werden kann. Hämatoxylin und Eosin-Färbung (H &amp; E) sollte die Abwesenheit von Kern-und Zytoplasma-Material unter Wahrung der Dünndarmschichten (3A) zu demonstrieren. Insbesondere sollte die Wartung der Zotten und Krypten auf der luminalen Seite ersichtlich ist folgende Rasterelektronenmikroskopie (Abbildung 4). AErhaltung der extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen, Elastin und Glycosaminoglycane auch erwartet werden. Zum Beispiel Masson Trichrom-Färbung zeigt intakte Bindegewebe im Gerüst (Abbildung 3B). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. . Versuchsplan Timeline der Dezellularisierung Verfahrens; PBS / AA: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Antibiotika-Antimykotikum, NaDeoxy: Natriumdeoxycholat, RT: Raumtemperatur, DNAse-I: Desoxyribonuclease-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> 2. Gerüst makroskopischmakroskopische Aussehen des Rattendünndarms nach erfolgreicher Dezellularisierung (A) c Eigenschaften.. Die Injektion von Farbstoff Ponceau Rosso durch die SMA zeigt eine intakte Gefäßnetz (B); SMA: A. mesenterica superior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> 3. . Histologie H &amp; E (A) und MT (B) Färbung zeigen die Abwesenheit von Zellmaterial mit der Erhaltung des Bindegewebes Architektur, H &amp; E: Hämatoxylin und Eosin, MT: Masson Trichrom. Maßstab:. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . </p&gt; <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> 4. . Elektronenmikroskopie Rasterelektronenmikroskopie zeigt die erhaltenen Zotten-crypt Architektur in den Gerüst Lumen; Maßstabsbalken:. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Der Artikel beschreibt eine Methode für die Herstellung einer azellulären Matrix aus Rattendarm. Die Ableitung von Darm Gerüste ist wichtig für zukünftige Anwendungen im Tissue Engineering, Stammzellbiologie und Drogentests.

Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K Aufrufe.  University College London.  Der Artikel beschreibt eine Methode für die Herstellung einer azellulären Matrix aus Rattendarm. Die Ableitung von Darm Gerüste ist wichtig für zukünftige Anwendungen im Tissue Engineering, Stammzellbiologie und Drogentests. 

Serie: A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Forschung

Biotechnik

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization des ganzen menschlichen Herz in einem unter Druck stehenden Beutel in eine umgekehrte Orientierung

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

Herstellung von membrangefilterten Phase-Shift-Decafluorbutan-Nanotröpfchen aus vorgeformten Mikrobläschen

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Aufbau einer mikrofluidischen Vorrichtung zur kombinatorischen Steckerherstellung

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Autor im Rampenlicht: Integration von computergestützten und experimentellen Ansätzen in der Präzisionsonkologie

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Zweischichtiges mikrofluidisches Gerät für die kombinatorische Steckerproduktion

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...