Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Mechanismen der Zellteilung im Kontext des lebenden, intakten Gewebes mittels Fluoreszenzmikroskopie zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die physiologischen Umgebungen der Zellen erhalten bleiben und gleichzeitig live bildergebend über lange Zeitkurse hinweg möglich sind. Der wichtigste Teil dieser Technik ist sicherzustellen, dass die Hoden nicht während der Zerlegung oder Montage beschädigt werden.
Dies ist eine Fähigkeit, die mit ein wenig Zeit und Übung erworben wird. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie zeigt, wie die Hoden identifiziert und isoliert werden und wie sie für die Bildgebung bereitgestellt werden, ohne das Gewebe zu beschädigen. Bereiten Sie Tiere, Werkzeuge und Medien vor, wie im Manuskript beschrieben.
Bevor Sie mit der Zerlegung beginnen, verwenden Sie die mediengefüllte Filterspritze, um drei Tropfen Medien pro 50 Mikroliter an der Ober-, Mittel- und Unterseite eines Glasschlittens zu vertreiben. Übertragen Sie mit einer Sezsonde fünf bis zehn Drittel der Instar-Larven oder frühen Pupae auf den oberen Tropfen der Medien auf der Folie. Rühren Sie die Larven und Pupas in den Medien vorsichtig mit der Sezierenderon, um Lebensmittel oder Trümmer zu entfernen.
Verwenden Sie die Sezierensonde, um eine einzelne Larve oder Pupae auf ihre Seite zu drehen. Achten Sie auf die beiden bilateralen Hoden, die als durchscheinende ovale Strukturen auf dem hinteren Drittel des Körpers erscheinen. Tiere ohne Hoden sind weiblich und sollten entsorgt werden.
Wenn eine männliche Larve oder Pupae gefunden wird und sauber ist, bewegen Sie sie auf den zweiten Tropfen der Medien. Wiederholen Sie dies, bis drei oder vier männliche Larven oder Pupae auf den zweiten Tropfen Medien übertragen wurden. Dann im zweiten Tropfen der Medien arbeiten, greifen Sie ein einzelnes Tier mit einem Paar Zange in seiner Mitte-Region, nur vor den Hoden.
Verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um das Tier sanft in die Hälfte zu reißen. Halten Sie mit einem Zangenpaar das hintere Ende des Tieres auf der Glasrutsche fest. Beginnend direkt neben der Zange, drücken Sie auf die Nagelhaut mit der Kante des Skalpells.
Bewegen Sie das Skalpell in Richtung des geschnittenen Endes des Tieres. Dadurch werden die inneren Organe des Tieres, zu denen die Darm-, Fettkörper und Hoden gehören, ausgegart sein. Die Hoden sind farblose und fast transparente ovale Organe in Bänder des Fettkörpers eingebettet.
Die Hoden sanft von den übrigen Organen trennen. Um die Hoden nacheinander zu übertragen, legen Sie die Kante des Skalpells unter den Fettkörper, heben Sie das Gewebe aus den Medien und bewegen Sie es schnell zum dritten Tropfen. Wenn nicht genügend Fettkörper noch an den Hoden befestigt ist, um das Gewebe mit dem Skalpell zu heben, verwenden Sie eine Glas Pasteur Pipette, die mit Seziermedium vorgewettet wurde.
Arbeiten im dritten Tropfen des Mediums, verwenden Sie das scharfe Ende des Skalpells, um überschüssigen Fettkörper sanft von den Hoden zu schneiden, so dass nur ein kleiner Rand von Fettkörper um die Ränder. Verwenden Sie zunächst die Filterspritze, um einen einzigen Tropfen von Schneiders Medium etwa 30 Mikroliter auf die Mitte einer 50 Millimeter gasdurchlässigen Kulturschale zu legen. Mit dem Skalpellwerkzeug oder einer vorgewetteten Pasteurpipette bis zu fünf der vorbereiteten Hoden auf den Tropfen auf der Schale übertragen.
Als nächstes verwenden Sie das Skalpell-Werkzeug, um die Hoden sanft auf die gasdurchlässige Membran und in die Mitte des Tropfens des Mediums zu schieben. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze legen Sie vier Tropfen Halocarbonöl auf die gasdurchlässige Membran, die den Tropfen des Mediums umgibt. Die Positionen der Tropfen sollten den vier Ecken eines 22-Millimeter-Abdeckslips entsprechen.
Richten Sie dann die Ecken eines 22-Millimeter-Glasdeckels mit den vier Tropfen Halocarbonöl aus und senken Sie den Deckelrutsch vorsichtig auf die Medien und das Öl. Lassen Sie den Deckelschein absetzen, und für die Medien, die die Hoden enthalten, die Ausbreitung zwischen den Öltropfen. Stellen Sie das Kulturgericht unter ein Sezierendes Mikroskop.
Um überschüssige Medien zu entfernen, legen Sie die Ecke eines empfindlichen Aufgabenwischs unter den Deckzettel ein. Wick weg genug Medien für die Glasabdeckungslip, um nur Kontakt mit der Oberfläche der größten Hoden zu machen. Entfernen Sie nicht zu viele Medien und senken Sie den Coverslip zu weit.
Dies übt Druck auf die Hoden aus und kann zu einem Bruch führen. Schließlich legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf die Glasabdeckung kurz über den Hoden. Drehen Sie die Schale um und legen Sie sie auf die Mikroskopbühne.
Bewegen Sie das 40- oder 60-X-Mikroskopobjektiv in das Öl, bis es knapp unter den Hoden liegt. Verwenden Sie Durchlicht, um einen einzelnen Hoden zu finden und in den Fokus zu rücken. Legen Sie 0,5 Milliliter 8%Paraformaldehyd in PBSTx in einen Brunnen einer neun gut sezierenden Schale.
Verwenden Sie eine glasende Pasteurpipette, um bis zu 10 der Hoden in den Brunnen zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Hoden auf dem Boden des Brunnens liegen. Nach 20 Minuten die Hoden auf einen Brunnen mit 0,5 MilliliterPBSTx übertragen.
Waschen Sie die Hoden, indem Sie sich fünf Minuten lang sanft aufregen. Waschen Sie noch zwei Mal in neuen Brunnen mit frischem PBSTx. Bereiten Sie eine Verdünnung des primären Antikörpers in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr vor, wie im Manuskript beschrieben.
Dann die Hoden von der neun Brunnenglas-Sesektierungsschale in die Röhre geben. Inkubieren Sie die Röhre über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Schaukeln oder Nuss. Das Verfahren zur Färbung der Hoden mit dem sekundären Antikörper ist ähnlich.
Weitere Informationen finden Sie im Manuskript. Übertragen Sie zunächst mit einer Pasteur-Pipette die Hoden von der neun Brunnenplatte auf ein Glasmikroskopie-Dia. Verwenden Sie bei Bedarf die Kante des Skalpells, um die Hoden auf die Oberfläche des Schlittens zu schieben.
Als nächstes verwenden Sie die Ecke einer heiklen Aufgabe wischen, um überschüssige Flüssigkeit aus den Hoden abzuleiten. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich. Dann einen 30 bis 50 Mikroliter Tropfen Mikroskopie Montagemedium auf die Hoden auftragen.
Schließlich legen Sie einen 22-Millimeter-Deckelaufschlag auf den Tropfen des Montagemediums. Lassen Sie den Deckelschlupf sich absetzen und das Montagemedium unter dem Deckschein verteilen. Wenden Sie bei Bedarf sanften Druck auf den Deckelschlupf an, um überschüssiges Montagemedium herauszupressen und den Deckelrutsch auf der Oberfläche der Hoden ruhen zu lassen.
Wenn dieses Protokoll erfolgreich ausgeführt wird, bleibt die zelluläre Organisation der Hoden erhalten, und der Verlauf der Zelldifferenzierung von einem Ende des Hodens zum anderen ist sichtbar. Spermatozyten im Begriff, Meiose zu beginnen und diejenigen in metaphase können identifiziert werden. In Mit diesem Protokoll erstellten Hoden zeigt die Live-Bildgebungsanalyse die dynamische Reorganisation des endoplasmatischen Retikulums und der Mikrotubuli bei der Teilung von Spermatozyten.
Wie im Protokoll beschrieben, muss sehr darauf geachtet werden, keinen Druck auszuüben, der zum Platzen der Hoden führt. Zysten von Spermatozyten fließen schnell aus einem gebrochenen Hoden, was die Live-Zeitraffer-Bildgebung erschwert. Dieses Protokoll ist für die Bildgebung der Teilung von Spermatozyten in lebendem, intaktem Gewebe optimiert.
Daher ist es wichtig, dass die Hoden nicht während der Zerlegung oder Montage beschädigt werden. Unsere Methode sollte auch für hochauflösende Bildgebungstechniken wie die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie geeignet sein, die neue Einblicke in dynamische subzelluläre Prozesse bietet, die die Zellteilung steuern.
