Die Autoren danken ihren Finanzierungsquellen, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education-Programm, um das College of William and Mary; Zuschuss Sponsor: NIH (MSS); Förderkennzeichen: R15NS067566. Sie Unterstützung vom College of William and Mary, Fachbereich Biologie und der Hochschule für Künste und der Wissenschaften für die Unterstützung bei der Tierpflege auch anerkennen.

Ethik-Erklärung: Die Methoden wurden mit domestizierten Zebrafinken aus der Brutkolonie am College of William and Mary durchgeführt. Alle Verfahren gefolgt RSPCA Richtlinien 23 und wurden von der College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Tierschutz Assurance (# A3713-01) zugelassen und hatte Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Genehmigung (# 2013-06 -02 bis 8721-dacris). 1. Egg-Sammlung und Inkubation <ol><li> Stellen Zebrafinken Paare auf einem 14.10 Licht: Dunkel-Zyklus. Liefern Nahrung, Wasser, Heu und einen Nistkasten ad libitum. Hinweis: Regelmäßige Pflege und Zucht für Zebrafinken hat gut beschrieben worden 23. </li><li> Bereiten Sie eine Standard-Küken Inkubator mit Neige Regalen. Hinweis: Halten des künstlichen Inkubator bei 37,5 (+ / - 1) ° C 80 - 95% Feuchtigkeit durch Zugabe von Wasser auf den Boden des Inkubators auf einer täglichen Basis. Lassen Sie den Inkubator für zwei Tage ins Gleichgewichtbevor Sie. <ol><li> Wählen Sie kleine Futterbecher (5 x 7,6 cm) mindestens 2,5 cm tief, um Eier in den Inkubator zu halten. Den Boden und unteren Rand der Tasse mit zwei Lagen Küchenpapier, so dass die Tasse ist gepolstert, während weiterhin die Eier leicht rollen. Legen Sie diese Tassen auf den Regalen Kippen des Inkubators. Hinweis: Zu viel Polsterung können Roll hemmen, die erfolgreiche Inkubation durch embryonale Haftung an der Innenschale verhindert. </li></ol></li><li> Sammeln der Eier bei zwei Stunden nach dem Beginn der Lichtzyklus. Hinweis: Dies minimiert Abweichungen in Entwicklungsphase für eine bestimmte Inkubationszeit wegen Eltern Inkubation. <ol><li> Pick up Eier vorsichtig mit Daumen und Zeigefinger an der Spitze und Basis entlang der Länge des Eies. Verwenden Sie eine matte, weiche 4B Bleistift, um die festgelegten Datum und Zeit aus dem Nest gesammelt zu beschriften. Hinweis: Das weichere Bleistift 4B verringert das Risiko des Bleistifts Brechen der zerbrechlichen Eierschale. </li><li> 1.3.2) Legen Sie 1-5 markierte Eier in jedem cim Brutschrank so daß Eier frei rollen embryonale Haftung auf dem Inneren des Gehäuses zu verhindern. Hinweis: Wenn sich mehr als 5 Eier in einer Tasse können Rollen der einzelnen Eier zu verhindern und reduzieren die Lebensfähigkeit von Embryonen. </li></ol></li></ol> 2. Entfernung der Embryo aus Egg <ol><li> Um für die Präparation vorzubereiten, montieren die folgenden Materialien: ein sauberes Skalpell, Pinzette mit feiner Spitze und zwei extra feine Spitze Pinzette. Zeigen 10 x 10 cm wiegen Papier auf der Basis des Binokular, um eine saubere, nicht-saugfähige Oberfläche für die Präparation zu liefern. Hinweis: Das Papiergewicht ist entscheidend, denn es ermöglicht eine einfache Handhabung des Eigelbs und die beste Oberfläche für das Schneiden der empfindlichen Membranen mit einem Skalpell. </li><li> Vorbereitung eines Aliquots phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1X PBS) in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen, und mindestens drei Transferpipetten und eine kleine Abfallbehälter zu erwerben. Wenn die Festsetzung der Embryonen, bereiten einen aliquoten Teil 4% Paraformaldehyd (PFA). Vorsicht: PFA Dämpfe sind giftig, eind alle Schritte mit PFA sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um die Exposition zu minimieren. Wenn Flash Einfrieren der Embryonen zu erhalten flüssigem Stickstoff und halten Sie sie in der Nähe des Binokular. Sterilität ist nicht ein Problem für diese Präparation-Protokoll, sondern sicherzustellen, dass alle Materialien sind sauber. </li><li> Entfernen Sie das Ei aus dem Brutschrank bei dem für die gewünschte Stufe, wie in der Zebrafinken Inszenierung Führung 22 beschrieben benötigt Zeitpunkt. Hinweis: Entfernen Sie Eier nach 36 h Inkubation zu Stufe 6 Embryonen (4A) 22 sezieren und Eier zu entfernen nach 56 h Inkubation Stufe sezieren 12 Embryonen (3A) 22. </li><li> Mit Hilfe eines faseroptischen Beleuchtungslampe, Kerzen das Ei, indem Sie sie entlang der vertikalen Achse und Glanz Licht durch das Ei, um den Innenraum zu beleuchten. Setzen Sie die Spitze des Lichts hinter dem Ei und suchen Sie das Eigelb und den sich entwickelnden Embryo. <ol><li> Positionieren Sie das Skalpell auf der gegenüberliegenden Seite der Dotter und schneiden entlang der Ei von der Spitze bisBasis mit schwachen Druck. </li></ol></li><li> Die Inhalte des Eis vorsichtig entfernen, indem Druck auf die Spitze und der Basis des Ei mit dem Daumen und dem Zeigefinger oder durch Abdeckung vorsichtig auseinander die Eierschale entlang dem Schnitt mit einer Pinzette. Öffnen Sie das Ei direkt über dem Papier wiegen, so dass das Eigelb rollt vorsichtig heraus. </li><li> Untersuchen Sie das Eigelb für die weiße Zone der Kreuzung, die als schwachen weißen Ring um die embryonale Entwicklung zu sehen ist, und richten das Eigelb mit extra feine Spitze Pinzette, so dass der Embryo in der Mitte. Hinweis: Wenn ein schwacher weißer Kreis auf der Oberfläche des Eigelbs nicht beachtet wird, nehmen Sie die feinen Pinzette und sanft rollen, bis das Eigelb über der Embryo auf dem Eigelb. Hinweis: Für die Stufen 1-9 22, ist die Keimscheibe weniger als 6 mm im Durchmesser und ist als eine schwache, leicht opake Scheibe auf der Oberfläche des Eigelbs sichtbar - siehe Abbildung 1 als Referenz. Für Stufen 10 und älter 22, Blutpools ermöglichen verbesserte visibility des Embryos, aber darauf achten, um zu vermeiden, Punktion der Dottersack, da dies das Auffinden des Embryos schwierig. </li></ol> 3. Trennung von Embryo aus extra-embryonalen Gewebe <ol><li> Stechen Sie die Kanten des Dotters, um Druck (Abbildung 1B) zu entlasten, und stellen Einzelschnitte über die Länge des Dotterdurchmesser neben der Keimscheibe. Wiederholen Herstellung dieser Diagonalen, bis der Abschnitt des Eigelbs, das die Embryos erfolgreich getrennt werden (Fig. 1B). Anmerkung: Dieser Schritt ermöglicht dem Dottermasse intakt zu bleiben, aber der Unterdruck auf der Oberfläche des Dotters ermöglicht mehr Präzision beim Schneiden um den Embryo und verhindert Schäden an embryonalen Strukturen. </li><li> Entfernen der Kanten des Eigelbs mit einer Transferpipette. Hinweis: Entfernen Sie so viel wie möglich Eigelb, aber lassen Sie eine kleine Menge, so dass der Embryo nicht auf die trockene Oberfläche der Papiergewicht und Verschleiß haften. </li><li> Waschen Sie die Keimscheibe durch Dispensing 1X PBS bei 45 °-Winkel zum Boden des Embryos. Setzen Sie die Spitze des Transferpipette neben-nicht oben embryonalen Platte. Wenn zusätzliche Eigelb entfernt werden muss, trennen jeden Eigelb mit dem Skalpell auf dem Papiergewicht, bevor die Übertragung des Embryos in eine Petrischale. Hinweis: Dieses Verfahren entfernt die Embryos aus der Oberfläche der Papiergewicht. </li><li> Übertragen des Embryos unter Verwendung einer Transferpipette zusammen mit einem minimalen Volumen von 1X PBS auf eine kleine Petrischale aus Kunststoff. Indem mehr 1X PBS in die Petrischale und Tropf 1X PBS in der Nähe, aber nicht direkt an, den Embryo zu waschen, den Embryo. Schwenken Sie die Petrischale mit der Transferpipette waschen und Rest Eigelb, neigen Sie die Petrischale, und entfernen Abfall 1X PBS. HINWEIS: Wenn das 1X PBS entfernt wird, der Embryo in der Regel nicht auf den Boden der Petrischale zu halten, weil die Kunststoffoberfläche rutschig mit Rest 1X PBS ist. Es können jedoch mehr 1X PBS aufgenommen werden, wenn der Embryo klebt an der Schale. Wenn Befestigungs ter Embryo, befolgen Sie die Schritte 3.5 und 3.6. Wenn Flash Einfrieren des Embryos, fahren Sie sofort mit Schritt 3.8. </li><li> Wenn die Festsetzung der Embryo für eine in situ-Hybridisierung, sofort auf die Petrischale hinzuzufügen 4% PFA, den Embryo einzutauchen. Drip 4% PFA direkt auf der Spitze des Embryos, um sie zu glätten; dies verhindert, dass der Embryo aus Eisstockschießen. Fix den Embryo in 4% PFA bei 4 ° C für 12 Stunden. <ol><li> Nach der Fixierung, dehydrieren Embryonen in abgestuften Methanol (MeOH)-Lösungen und bei -20 ° C in 100% MeOH. </li></ol></li><li> Wenn der Embryo zwischen den Stufen 1-8 22, entfernen Sie die Dotterhaut des Embryos eingehalten werden. Anmerkung: Dieser Schritt kann während oder nach der Fixierung erfolgen. Die Embryonen, die jünger als 22 Stufe 8 sind nicht leicht sichtbar, weil sie auf die Dotterhaut haften, verdeckt Schlüsselstrukturen wie in 2A gesehen. <ol><li> Fassen Sie den Rand der Membran, die über den Bereich der Kreuzung mit extra feinen Pinzette erstreckt. CAREFUlly Flip den Embryo über mehrmals weg zu waschen Restdotterkörnchen und die Einhaltung der embryonalen Platte auf die Dotterhaut zu lösen. Hinweis: Berühren Sie nicht die Mitte des Embryos, da dies embryonalen Strukturen beschädigen. </li><li> Wenn eine Lücke nicht zwischen der Zone des Übergangs und der Dotterhaut erscheinen, sanft kratzen die Zone der Kreuzung mit der extra feine Spitze Pinzette, um sie vom Dotterhaut zu lösen. Fassen Sie die Dotterhaut mit dem extra feinen Spitzen Pinzette und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Embryo. Falls erforderlich, ziehen die Embryos aus dem Dotterhaut durch Greifen des Umfangsrands der Keimscheibe in der Zone der Kreuzung. </li><li> Entsorgen Sie die Dotterhaut in ein Biohazard Abfall (Sicherheitsstufe 1) nach der Entfernung. </li></ol></li><li> Bei der Durchführung eines ISH-Test auf junge embryonalen Stadien, folgen Standard ganze Berg ISH Protokolle für Hühnerembryonen 24, 25, aber die folgenden Vorschläge. <ol&gt; <li> Um Schäden an den Embryonen während der ISH Verfahren zu reduzieren, mit einer einzigen 5-ml-Glasfläschchen mit Schraubverschluss für jeden Embryo. Nur Fläschchen füllen mit 2 - 3 ml Lösung, um sicherzustellen, dass die Embryonen vollständig untergetaucht. Nutieren Fläschchen vertikal, indem 5 ml-Fläschchen in einem Styropor-Rack (oder einem Rack, das die Fläschchen sicher halten wird), die zu einer Nutator gesichert ist. Anmerkung: Diese Vorsichtsmaßnahme verhindert, dass der Embryo aus Zerreißen, was auftreten kann, wenn es in Kontakt mit dem Deckel der Ampulle während der horizontalen Nutation kommt. </li><li> Für Embryonen Stufe 0-6 22, Behandlung mit 5 ug / ml Proteinase K in 1X PTW für 5 min bei Raumtemperatur. Behandeln Embryonen statt 7-12 22 mit 10 &amp;mgr; g / ml Proteinase K in 1X PTW 10 min bei 37 ° C bis die Hintergrundfärbung zu reduzieren. </li><li> Um eine ausreichende Farbreaktion zu erzeugen niedrigen Niveaus der Genexpression in den Stufen 1 zu erkennen - 10 22, Inkubation mit 10 &amp;mgr; g / ml Konzentration der Sonde für 12 Stunden. Für ältere Stadien, Inkubation mit 1 &amp; #956; g / ml Sondenkonzentration bei 60 ° C. </li></ol></li><li> Auf der Petrischale 3 ml 1X PBS folgenden Dissektion und neigen Sie den Petrischale, um den Embryo aus den Dotterkörnchen trennen - Wenn Flash-Einfrieren des Embryos, schnell hinzufügen 2. Flüssigkeit entfernen und wiederholen Sie 2 - 3 mal, alle Eigelb entfernen. Mit feinen Spitzen Pinzette Transfer-Embryo zu einem vor-markierten Mikrozentrifugenröhrchen und Flash-Freeze in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 ° C </li></ol> 4. EdU Cell Proliferation Assay. Satzung und dem Nachweis von EdU in Zebra Finch Embryonen. <ol><li> Candle das Ei mit einem faseroptischen Beleuchtungslampe, um den Embryo oder Eigelb zu finden. </li><li> Markieren Sie die Seite des Eis gegenüber der Position des Embryos oder des Eigelbs innerhalb des Eies um sicherzustellen, dass der Embryo während der Mikroinjektion beschädigt. </li><li> Linie eine 60 mm-Kunststoffschale mit Modelliermasse und Schimmel in der Form einer Schale, um das Ei in der gewünschten Ausrichtung zu halten. Die markierte Stelle sollteorientiert, um das Einführen des Mikroinjektionsnadel mit dem Mikromanipulator ermöglicht. Hinweis: Der Ton wird das Ei während die Mikroinjektion und während der Inkubation von Schritt 4.11 stabilisieren. </li><li> Ziehen Sie zwei Glaskapillare Mikroinjektion Nadeln. Blunt eine Nadel, ein Loch in das Ei an der markierten Stelle stecken. Bereiten Sie den zweiten Mikroinjektionsnadel zum Einspritzen von backloading es mit Mineralöl und Einsetzen in die Mikroinjektor. </li><li> Stellen Sie das Volumen der Lösung pro Injektion auf 59,8 nl auf der Mikroinjektor veröffentlicht. </li><li> Laden Sie die Mikroinjektionsnadel mit der 10 mM Stamm EdU Lösung. </li><li> Erstellen Sie ein Loch in die Schale auf der markierten Stelle mit dem abgestumpften Glaskapillare, kümmert sich um die Schale nicht zerbrechen oder fallen Stücke der Schale in das Ei Höhle. Ausrichten des Ei so dass das Loch in einem 45 ° Winkel, so dass der Mikroinjektionsnadel direkt durch den Hohlraum zu dem Eigelb oder Embryo eingeführt werden. </li><li> Mit dem Mikromanipulator, legen Sie diegeladen Nadel etwa 1,0 cm in den Hohlraum. </li><li> Spritzen Sie die gewünschte Menge des EdU Lösung direkt auf den sich entwickelnden Embryo oder Eigelb. Hinweis: Es können maximal 478 nl EdU können, ohne dass es in der embryonalen Tod injiziert werden. </li><li> Unmittelbar wickeln Sie das Ei und den Ton Halter mit mehreren Schichten von Plastikfolie, um das Ei und die Schale, um ein Austrocknen des Embryos während der Inkubation zu verhindern abzudecken. Band die Ränder der Plastikfolie an den Boden der Schale, um den Kunststoff vor dem Entfernen während der Inkubation zu verhindern. Hinweis: Die Plastikfolie sollte erst unmittelbar vor der Präparation entfernt werden. </li><li> Ermöglichen, dass die neu proliferierende Zellen, die EdU durch Inkubieren des Eis bei 37 ° C übernehmen, bis die gewünschte Stufe erreicht ist. Nach der Injektion nicht Ei zum Kippen Regale im Inkubator zurück. Setzen Sie den Kunststoffmantel Ton ausgekleidet Gericht auf stabile Oberfläche im Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Plastikverpackung und sezieren den Embryo nach dem oben genannten Protokoll.Befestigen des Embryos in 4% PFA und Inkubation 12 h bei 4 º C wie oben beschrieben. Nach der Fixierung, wäscht mit 100% Ethanol (EtOH) für 5 min und im frischen 100% EtOH bei -20 ° C bis zur weiteren Analyse. </li></ol> 5. EdU &quot;Click&quot;-Protokoll für Die folgenden Schritte sind alle in Glasflaschen durchgeführt. <ol><li> Rehydrate Embryonen mit aufeinanderfolgenden 5 Minuten wäscht der folgenden: </li><li> EtOH, 75% EtOH und 25% sterilem entionisiertem destilliertem (SDD) Wasser, 50% und 50% EtOH sdd Wasser, 25% und 75% EtOH 1X PTW, 100% 1X Ptw </li><li> Drei Mal Waschen in 100% 1X PTW 10 min je. </li><li> Verdünnen Sie die Reaktionspuffer Additiv (Kit Komponente F) durch die Kombination von 1 Teil des 10X Lager Pufferlösung (10 ul) auf 9 Teile sdd Wasser (90 ul). </li><li> Bereiten Sie die Reaktionsmischung in einem separaten Röhrchen durch Vermischen der folgenden: 875 ul 1X PBS, 20 &amp;mgr; l CuSO 4, 5 &amp;mgr; l Azid, 100 ul Reaktionspuffer verdünnt Additiv.Hinweis: Volumen des Reaktionsgemisches kann verkleinert werden. Die Reaktion wird funktionieren, wenn der Embryo ist vollständig in der Reaktionsmischung bedeckt. In der verdünnten Reaktionspuffer Additiv (Schritt 5.3) unmittelbar vor der Verwendung. Alle nachfolgenden Schritte werden in der Dunkelheit durchgeführt. Decken Sie die Embryonen mit Folie aus dem Licht zu schützen. </li><li> Decken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie und inkubieren sie vertikal bei Raumtemperatur für zwei Stunden, indem sie in einem Styropor-Rack zu einem Kolbenpendel angebracht. </li><li> 3-mal Waschen der Embryonen in frischem 1X PBS für jeweils 10 Minuten. </li><li> Die Embryonen in 4% PFA frisch über Nacht bei 4 ° C inkubieren </li><li> 3-mal Waschen in 1X PBS für jeweils 10 Minuten und im frischen 1X PBS bei 4 ° C Decken Sie die Embryonen mit Folie bis zur weiteren Analyse. </li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development:+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus.">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li><li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites.">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li><li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Neueste Entwicklung eines embryologischen Staging Führung 22 und Genom-Annotation machen die Zebrafinken eine wünschenswerte Modellorganismus für Entwicklungsstudien. Doch die geringe Größe und Zerbrechlichkeit der Zebrafinken Embryonen, die von 3 bis 7 mm in den Stufen 1 reichen - können 10 22, Dissektionen schwierig machen 11, 14. Lokalisieren und sauberen Entfernen Embryonen von der Oberfläche des Eigelbs kann schwierig sein. Dieses Protokoll bietet ausreichend detailliert, das Verfahren mit Leichtigkeit auszuführen. Dieses Protokoll zeigt die kritischen Schritte, die nicht in der Regel bekannt, aber notwendig sind, um eine erfolgreiche Präparation zu gewährleisten. Zum Beispiel ist es wichtig, eine kleine Schicht von Eigelb zwischen dem Embryo und Blatt Papier wiegen auszuschließen kleben lassen. Sowohl die Identifizierung und Entfernung des Embryos kann schwierig sein. Zu beheben Identifizierung des Embryos auf der Oberfläche des Dotters, strahlen Licht direkt über dem Dotter nach hat eswurde aus dem Ei entfernt, und schauen Sie sich das Eigelb in einem 45 °-Winkel, um den Embryo zu finden. Sobald der Embryo befindet, schneiden Sie das Eigelb auf einem Papiergewicht kümmert, um den Embryo nicht zu reißen. Wenn weitere Anwendungen sind für Abbildungs ​​anatomischen Unterschiede, in situ Hybridisierung oder Zellproliferationsassays, ist es wichtig, die Dotterhaut in Stufe 1 zu entfernen - 8 22 zur besseren Veranschaulichung der Strukturen. Wenn Schwierigkeiten beim Entfernen der Eigelb oder die Dotterhaut in frühen Stadien, fix den Embryo in 4% PFA vor dem Waschen in 1X PBS zu embryonalen Anfälligkeit zu verringern. Durch die ersten Dotterhaut Entfernen bei der Präparation, wie beschrieben, sind die Strukturen deutlich sichtbar und unversehrt in Zebrafinken Embryonen nach der Durchführung einer in-situ-Hybridisierung. Eine Einschränkung der EdU ist, dass die Verabreichung von Dosierungsmengen über 478 nl führt zu embryonalen Todesfall. Allerdings erlaubt die große Dosierungsbereich varying Ebenen der proliferativen Zell Tagging. Die &quot;Klick&quot;-Reaktion in diesem Kit verwendet wird, ist die Kupfer (I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition-(Cu (I)-AAC). In dieser spezifischen Reaktion wird ein Alkin-haltigen Thymidin-Analogon-Molekül (EDU) von aktiv teilenden Zellen eingebaut. Das Alkin-Gruppe in der EDU ragt aus der helikalen Struktur der DNA und wird durch Belichtung mit einem Azid-Molekül zu einem grünen, fluoreszierenden Molekül, das an dem freien Alkin-Gruppe bindet, konjugiert. Die grüne Fluoreszenz zeigt die neu proliferierende Zellen im Embryo. Die Bio-Orthogonalität der Azid-Alkin-Gruppen und die verhindert, dass nicht-spezifische Färbung, weil diese reaktiven Spezies sind nicht natürlich in Organismen vor. Auch, weil die DNA nicht benötigen, um die Reaktion stattfinden denaturiert werden, können weitere DNA-abhängige Analyse leicht durchgeführt 27. Eine inhärente Einschränkung dieser Methode ist die geringe Größe und fragility von Zebrafinken Embryonen. Entfernen der Dotterhaut von Embryonen Stufen 1-15 22 in schädlichen embryonalen Strukturen führen, wenn nicht mit Vorsicht durchgeführt. Dieses Protokoll vereinfacht jedoch die Dissektion Verfahren, so dass die Ermittler zu frühen embryonalen Stadien nutzen, um strukturelle Anomalien und der Genexpression, die nicht vorher eingehend untersucht haben, zu untersuchen. Dieses Protokoll öffnet den Weg für eine Vielzahl von zellulären Assays, welche Molekular die Ermittler, um die Entwicklungs Ursprünge der Erwachsenen Phänotypen bestimmen werden. Zum Beispiel wird es möglich sein zu prüfen, Genexpression unter verschiedenen Umweltbedingungen in Verbindung gebracht oder Gesangslern folgenden pharmakologischen Behandlungen in den frühesten Entwicklungsstadien 28, 29,30,31. Obwohl in dieser Arbeit nicht gezeigt hat, erlaubt dieses Verfahren möglicherweise für andere Verfahren wie radioaktive in situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten Zebrafinken und Elektroporation / in ovo Chirurgie 32, 33,34. Da der Zebrafink wurde als ein wichtiger Modellorganismus in einem riesigen Körper der Literatur etabliert, wie Studien ungenutzte Möglichkeiten zur Entwicklungsmechanismen mit erwachsenen Physiologie und Verhalten zu verknüpfen, insbesondere die Entwicklung der Sprache 7, 9.

Das Ziel dieser Technik ist es, Zebrafinken (Taeniopygia guttata) Embryonen aus den frühesten Stadien der Embryogenese für den Einsatz in einer breiten Palette von Entwicklungsstudien zu erhalten. Zebra-Finken haben sich die vorherrschende Singvogel Modellorganismus und haben ausführlich in einer Vielzahl von Bereichen, einschließlich Toxikologie 1,2, 3 Verhalten, Gedächtnis und Lernen 4,5,6, vergleichende Neuroanatomie 7,8, 9,10 und Sprachentwicklung eingesetzt . Als der einzige Singvogel mit einem sequenzierten Genoms ermöglicht die Zebrafinken molekulare und genetische Untersuchung der Passeriformes Ordnung, die über 50% der bekannten Vogelarten, 11, 12,13 darstellt. Trotz der Verwendung von erwachsenen und jugendlichen Zebrafinken in einer Vielfalt von Bereichen haben nur wenige Studien auf Zebrafink Embryonen insbesondere während der frühen Phasen der Entwicklung durchgeführt wurde. Dies ist auf die geringe Größe der Eier zurückzuführennd Embryonen und ihre neueren Status als Modellorganismus für 14,15,16 Studien, in denen das Huhn (Gallus gallus domesticus) wurde zuvor als vorherrschende Modellsystem verwendet, 17,18,19,20,21. Als nicht-stimmlichen Lernenden sind jedoch Hühner kein geeignetes Modellsystem für die Untersuchung der genetischen Grundlagen der Spracherwerb, die Entwicklung von Spracherwerb, Erblichkeit, das Verhalten und den kortikalen Basalganglien-Schaltung in 10 motorischen Lernen beteiligt. Es ist wichtig zu beachten, dass Zebrafinken Embryonen sind viel empfindlicher und leicht beschädigt, als Hühnerembryonen bei der Präparation und molekulare Verfahren. Insbesondere ist größere Sorgfalt erforderlich, wenn die Durchführung Permeabilisierung Schritte auf Zebrafinken Embryonen. Starke Reinigungsmittel und Enzyme, die nicht schaden würde einen Hühnerembryo können Zebrafinken Embryonen schädigen. In Bezug auf die allgemeine Pflege, ist es notwendig, Zebrafinken Eier in kleinen Tassen vor der Platzierung in einem Brutschrank gestelltum sie zu brechen beim Rollen während der Inkubation zu verhindern. Zebrafinken sind zugänglich für Verhaltensstudien, einfach und produktiv zu züchten jährig in Gefangenschaft, und Gesangslernende. Diese Eigenschaften ermöglichen die Verwendung von Zebrafinken, die Notwendigkeit für einen Modellorganismus, die Entwicklung, Genetik und Verhaltensaspekte der Sprache integriert ehen. Die Dissektionen Methoden unten beschrieben, verbunden mit einem neu entwickelten Inszenierung Führungs spezifischen Zebrafinken 22, machen den Zebrafinken ein immer nützlich, standardisierte Entwicklungsmodell Organismus. Allerdings erhalten Embryonen in frühen Stadien kann entmutigend sein. Dieses Protokoll ermöglicht die Ermittler leicht Embryonen im Frühstadium zu erhalten. Studien, die die frühe Entwicklung und der molekularen Entwicklungs Grundlage komplexer Verhaltensweisen in Zebrafinken oder die toxikologischen Wirkungen auf die Entwicklung in anderen klein, Sperlingsvögel finden diese Dissektion Methodik nützlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chicken egg incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Olympus SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7&#39;&#39; Drummond capillary for Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-00-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Nanoject II microinjector</td>
			<td colspan="2">Drummond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers #55</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td align="right">14099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tube (polypropylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep Lysis Matrix H tubes</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>6917-100</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries&#160;</td>
			<td colspan="2">Fiber-Lite MI-150&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials with screw cap (DEPC treated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modeling Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narshige PB-7 needle puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Omni Bead Ruptor Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">OMNI International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="3" height="25" style="height:25px;">4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS</td>
			<td>Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mL Plastic petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prepease RNA Spin Kit</td>
			<td>PrepEase, Affymetrix</td>
			<td>78766 1 KT</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reaction Mix: 875&#956;L 1xPBS, 100mM 20&#956;L CuSO4 (Kit Component E), 5&#956;L Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100&#956;L diluted reaction buffer additive (Kit Component F)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">sdd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seed cup&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use it as a container when incubating eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scalpel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard nest box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Abba Plastic Finch Nestboxes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes (polyethylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x4 weigh paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and downstream analysis of zebra finch embryos at early stages of development

Der Zebrafink (Taeniopygia guttata) ist ein zunehmend wichtiger Modellorganismus in vielen Bereichen der Forschung einschließlich Toxikologie 1, 2, 3 Verhalten und Gedächtnis-und Lern 4,5,6. Als der einzige Singvogel mit einem sequenzierten Genoms hat die Zebrafinken ein großes Potenzial für den Einsatz in Entwicklungsstudien; jedoch die frühen Stadien der Zebrafinken Entwicklung nicht gut untersucht. Mangel an Forschung in Zebrafinken Entwicklung ist auf die Schwierigkeit der Zerlegung der kleinen Ei und Embryo zugeschrieben werden. Die folgende Präparation Verfahren minimiert embryonalen Gewebeschäden, die zur Untersuchung der Morphologie und Genexpression in allen Stadien der embryonalen Entwicklung ermöglicht. Dies ermöglicht sowohl Hellfeld-und Fluoreszenzbildqualität von Embryonen, verwenden Sie in der molekularen Verfahren wie die in-situ-Hybridisierung (ISH), Zellproliferationsassays und RNA-Extraktion zur quantitativen Assays wie quantitative real-time PCR (qtRT-PCR). Diese Technik ermöglicht Ermittler frühen Phasen der Entwicklung, die bisher nur schwer zugänglich waren zu studieren.

Die in Fig. 1 schematisch Schritte zeigen das Aussehen des Embryos während im Dottermembran (A) angebracht und zeigen die richtige Methode, um die Embryos aus dem Eigelb (B) zu trennen. Der Embryo kann durch die Zone der Kreuzung, die viel leichter als die Dotterhaut ist identifiziert werden. Der Embryo selbst ist oft schwer zu unterscheiden, bis das Eigelb weggeschnitten. Nachdem der Embryo aus dem Ei seziert kann fest sein oder Blitz für die zukünftige Verwendung eingefroren. Wenn eine in situ-Hybridisierung für die Embryo zerlegt geplant ist, ist es notwendig, die Dottermembran, die über der Zone der Kreuzung des Embryos eingehalten wird, zu entfernen. Fig. 2 zeigt die verbesserte Sichtbarkeit des Embryos, sobald diese Membran wird entfernt (C), und der richtige Weg, um die Dotterhaut (A, B) schälen. Nach Präparation und Fixierung whole mount in situ-Hybridisierung wurde wie in Fig. 3 (A, A &#39;, B, B gesehen geführt&#39;) Und Fig. 4 (A, A&#39;, B, B &#39;) und 5 (A, B, C), um Unterschiede in orthodenticle Homeobox 2 (Otx2) Expression in Embryonen entwicklungs niedrigen Dosen ausgesetzt Methyl erfassen. 5 zeigt Sense-Sonde Ergebnisse demonstrieren Mangel an Hintergrund. In Abbildung 4, obwohl sie aus dem Ei in der gleichen Zeit Punkt seziert, der Embryo entwicklungsMethylQuecksilber (MeHg) ausgesetzt fortgeschritten bis Stufe 5 22 (B, B &#39;), während die Kontroll Embryo entwickelt zu Stufe 6 22 (A, A &quot;). Die Gruppe von Embryonen herausgeschnitten und in 4 gezeigt sind, wurden aus dem Nest gesammelt und aus dem Inkubator zu der gleichen Zeit aufgenommen. Obwohl einige natürliche Variation in der Entwicklung vorhanden ist, auf der Grundlage früherer Dissektion Daten ist es unwahrscheinlich, dass die Temperaturschwankungen im Inkubator verursachen würde nur die 2,4 ppm Methylquecksilber Embryonen entwi seinpmentally verzögert. Die Unterschiede in den Stadien zeigen Veränderungen in der Zellproliferation in Embryonen entwicklungsMethylQuecksilber ausgesetzt. Vor der Präparation wurde EdU in eine Eizelle injiziert Tag 2 und über Nacht inkubiert. Nach Präparation und Fixierung der Stufe 16 22 Embryos wurde EdU mit &quot;Klick&quot;-Chemie, die den Nachweis von proliferierenden Zellen wie in Fig. 6 (A, B, C) ​​gesehen, sichtbar gemacht. Es ist wichtig zu Zeitpunkten beim Platzieren Eier im Inkubator und während Dissektionen, wie Methylquecksilber oder Durchführung der EdU Test kann Entwicklungsfortschritt stören sorgfältig überwachen. Die früheste Injektion wurde am Tag 0, die der Tag der Sammlung, wie in Schritt 1.3 angegeben wurde durchgeführt. Dieser Embryo wurde etwa 38 Stunden später (Stufe 7 22) seziert. Die Überlebensrate wurde zu etwa 90% (mit derselben Geschwindigkeit wie Steuer Embryonen), solange der Einspritzmenge wurde unter 478 nl liegen. 22 Embryonen, wurde eine RNA-Extraktion gemß dem Protokoll des Herstellers ohne Optimierung erforderlich durchgeführt, wie in 7 zu sehen. Die Entfernung des Dotterhaut unnötig für die RNA-Extraktion und später qRT-PCR-Anwendungen. Anmerkung: Alle Embryos Figuren sind so orientiert, dass die vorderen und hinteren Bereiche sind an der Ober-und Unterseite der Bilder sind. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Verfahren zur Lokalisierung und sezieren Zebrafinken Embryonen Stufen 1-10 22. Suchen Embryo von sanften das Eigelb, bis die schwache weiße Scheibe ist offensichtlich, (A). Sobald derEmbryo wird in der Mitte des Eigelbs befindet, wird das Eigelb in einer schrittweisen Art (B), wobei der erste Schnitt entlastet der Dottermembran (1) und nachfolgende Schnitte (2) begrenzen den Bereich der Verbindungsstelle (zj) das ist, präpariert auf die Dotterhaut geklebt. Skalenbalken stellen 1 mm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Entfernung der Dotterhaut und die Sichtbarkeit der embryonalen Strukturen. Nach Entfernung des Embryos aus dem Eigelb, Ort Embryo in eine Petrischale mit 4% PFA. Wenn eine in situ Hybridisierung durchgeführt werden muss, ist die Sichtbarkeit der embryonalen Strukturen erforderlich und kann durch Entfernen der Dottermembran (A) erreicht werden. Fassen Sie die Dotterhaut mit extra feinen Spitzen Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig aus dem Embryo durch direkte Umgang mit dem Embryo am äußersten Rand, falls erforderlich(B). Dottermembranentfernung erhöht die Übersichtlichkeit von embryonalen Strukturen und erlaubt Embryonen in-situ-Hybridisierung (C) abgebildet oder mit verarbeitet werden. Maßstabsbalken repräsentieren 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Whole mount in situ Hybridisierung auf Zebrafinken Embryonen entwicklungs zu Expressionsmuster von orthodenticle Homöobox 2 (Otx2) Methylquecksilber. Ausgesetzt geführt wurden Embryonen auf 0,0 ppm Methylquecksilber (A, A &#39;) und 2,4 ppm Methylquecksilber (B, B ausgesetzt wird &#39;) über elterliche Ernährung. Die dorsal (A) und ventralen (A &#39;) Ausdruck der Otx2 ist sichtbar, während der Mittelhirn-und Augenblasen während der Stufe 12 22. Die Behandlungsgruppe Embryonen wurden in der gleichen Zeit Punkt seziert, sondern wurden als entwicklungspolitisch in der dorsalen gesehen (B) verzögert und ventralen (B &#39;) Sicht der Kopfstrukturen, die charakteristisch für Stufe 11 22 Abkürzungen sind:. mb, Mittelhirn; op, Augenblase. Skalenbalken stellen 1 mm. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Ganze Berg &#160; in situ &#160; Hybridisierung auf Zebrafinken Embryonen entwicklungs zu Expressionsmuster von orthodenticle Homöobox 2 (Otx2) Methylquecksilber. ausgesetzt durchgeführt wurden, in der Stufe 6 22 embry gekennzeichnet<html> os auf 0,0 ppm Methylquecksilber (A, A &#39;) und der Stufe 5 22 Embryonen bis 2,4 ppm Methylquecksilber (B, B ausgesetzt&#39;) über die elterliche Ernährung ausgesetzt. Abkürzungen: Uhr, Vorderrand des Mesoderm; nein, Chorda Chorda Mesoderm; po, proamnion, vordere Urmund; ps, Primitivstreifen 22. Skalenbalken stellen 1 mm. <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> Abbildung 5. Whole mount in situ &#160; Hybridisierung durchgeführt auf Zebrafink Embryonen mit Sense-Sonde. (A) Stufe 5 22 Embryos. (B) Early stage 6 22 Embryos. (C) Stufe 11 22 Embryos. Skalenbalken stellen 1 mm. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. EdU Gründung und de Schutz in Zebrafinken Embryonen. EdU &quot;Klick&quot;-Chemie wurde verwendet, um wuchernde Zellen in einem Stadium zu erkennen 16 22 Embryos (A, B, C). EdU wird in die DNA an die Stelle von Thymidin 26, 27 aufgenommen und wird mit Klick-Chemie 27 erfasst. Proliferation deutlich in den Seitenkanten der Somiten und der Schwanzknospen sichtbar. Panel A zeigt die Proliferation ausschließlich in dem hinteren Teil des Embryos vorkommen und zeigt einzelne proliferativen Zellen auch. Panel B zeigt die proliferative Orten im ganzen Embryo. Panel C zeigt die Frontzahnbereich, und zeigt die hoch proliferative Telen (te) im Detail. Abkürzungen: af, Frucht fach; FLB, forelimb Knospe; hlb, Hinterlauf Knospe; le, Linsenbläschen; ms, Hirn; mt, Metencephalon; OPC, Augenbecher; pa, Schlundbogen; sm, Somiten Mesoderm; tb, Schwanzknospen; te, Telen. Maßstabsbalken repräsentieren 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> Abbildung 7. Qualität von RNA aus seziert Zebrafinken Embryonen. Control (0,0 ppm) und 1,2 ppm Methylquecksilber Embryonen gewonnen wurden seziert und schockgefroren, wie in Schritt 3.8 beschrieben. Jede Spur zeigt RNA aus zwei homogenisierten Embryonen aus jeder Behandlungsgruppe extrahiert.

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Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Dissection und Downstream-Analyse von Zebra Finch Embryos in frühen Stadien der Entwicklung

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Aufrufe.  College of William and Mary. The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications. 

Serie: Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Forschung

Biologie

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...