The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

1. Nukleinsäure-Isolierung aus Gewebe HINWEIS: Co-Isolierung von DNA und RNA aus derselben Gewebeprobe bietet die Möglichkeit, DNA für die epigenetische Analyse und gepaarten RNA zur Genexpressionsanalyse zu sammeln. Das hier angegebene Beispiel ist eine Form der Säulenreinigung aus experimentellen Gewebe, sondern alternative Ansätze für die unterschiedlichen Probenarten oder andere Isolierungsverfahren können verwendet werden. Die Hauptanforderung ist für hoch gereinigte Nukleinsäure ohne Kontamination Protein oder organischen Lösungsmitteln. <ol><li> Wählen Sie ein Stück frisch gefrorenen oder frischen Gewebe für mechanische Homogenisierung und setzen auf Eis. Shop oder Übertragung Gewebe bis zu einer 2,0-ml-Rundmikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In einem 5 mm Edelstahl Perle in jedes Röhrchen Gewebe enthält. Dazu wird eine geeignete Menge Lysepuffer, basierend auf Hersteller Anregungen Zellenzahl oder der Gewebegewicht. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit Hilfe einer Perlmühle mechanische Homogenisierung bei30 Hz für 30 sec. HINWEIS: Die Frequenz und die Dauer der mechanischen Homogenisierung ist abhängig von der Gewebeart. Weichere Gewebe vollständig zu homogenisieren, mit den empfohlenen Einstellungen, während härtere Gewebe erfordern das Setzen Optimierung. </li><li> Führen Sie die DNA- und RNA-Isolierung unter Verwendung von Silica Spin-Säulen bei Raumtemperatur nach dem Protokoll des Herstellers. <ol><li> Elute RNA in 50 ul RNase-freies Wasser und auf Eis. Verwenden Sie für die RNA mRNA Expressionsanalyse von qPCR. </li><li> Eluieren der DNA in 100 ul TE Puffer. Wiederholen Sie die Elution aus DNA-Säule mit dem Laufmittel, um DNA-Konzentration und Ausbeute zu erhöhen. Verwenden Sie für die gezielte DNA-Methylierungs-Quantifizierung. </li></ol></li><li> Bewertung der Qualität der DNA und RNA unter Verwendung eines Standard-Spektrophotometers bei einer Absorption bei 230 nm, 260 nm, 280 nm und 320 nm. HINWEIS: A260 / A280-Verhältnis sollte ~ 1,8-2 für hochwertige DNA sein. A260 / A280-Verhältnis sollte ~ 2 für hochwertige RNA sein. Die Anwesenheit von überschüssigen Extinktion bei 230 nm indicates Verunreinigungen aus dem Isolierungsverfahren. </li><li> Qualität überprüfen Sie die RNA durch Verwendung einer Kapillarelektrophorese-Chip gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Hochwertige RNA wird eine RNA Integrity Number (RIN)&gt; 8. Das Vorhandensein von zusätzlichen Peaks im Elektropherogramm neben rRNA Peaks zeigen Probenkontamination. </li><li> Quantifizierung von DNA und RNA durch Fluoreszenzassay nach dem Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Die Verwendung eines fluorometrischen Assay ist empfindlicher und spezifischer für die Quantifizierung von Nukleinsäuren als Spektrophotometrie allein. </li><li> Speicher isolierte DNA und RNA bei -80 ° C. </li></ol> 2. Zielidentifizierung und Primer Design- <ol><li> Bestimmen Sie die genomischen Region (en) von Interesse von BSAS analysiert werden auf der Grundlage der entsprechenden Referenzgenomsequenz. Gen-Promotoren von differentiell exprimierte Gene sind häufig Ziele der Methylierung Quantifizierung. </li><li> Bereiten Sie ein in silico Bisulfit-converted Bezugsgenom für spätere Ausrichtung Sequenzierung liest durch Änderung der .fasta Sequenzdatei in einem Texteditor. In der 5&#39;-3&#39;-Orientierung, ersetzen nicht CpG Cytosin mit Thymin (Abbildung 2). </li><li> Design-Primer setzt, um Bereiche von Interesse von Bisulfit-konvertierter DNA zu verstärken. <ol><li> Markieren und kopieren Sie den nicht umgesetzten Region von Interesse, in der 5&#39;-3&#39;-Orientierung, in einer Bisulfit-spezifischen PCR-Primer-Design-Programm (Abbildung 3). HINWEIS: Eine optimale Bisulfit-PCR-Amplikon Länge 250-400 bp pro Amplicon als Bisulfitbehandlung Fragmente DNA und es ist schwierig, große&gt; 400 bp Regionen zu amplifizieren. Wenn beispielsweise von Interesse ist ein Bereich von 1 kb kann multiple Primerpaare entworfen, um diese Region abzudecken. Design-Amplikons zu gleicher bp Größe für das einfache Zusammenführung sein. Vermeiden Amplikonlängen &lt;250 bp, da diese möglicherweise nicht ausreichender Länge für Bibliothek Generation. Eine optimale Primerlänge für BSAS ist&gt;20 bp pro Primer. </li><li> Wählen Sie einen T m Bereich von 55 bis 65 ° C und einem max T m Unterschied zwischen Vorwärts- und Rückwärtsprimer von 1-2 ° C. </li><li> Wählen Primerpaare, die den interessierenden Bereich am besten zu decken. Primer, die CpG-Stellen enthalten oder direkt an CpG Wählen Sie nicht, da dies zu Verzerrungen bei den PCR-Reaktionen verursachen. Verwenden Sie Standard-PCR-Primer, die aus einer beliebigen Anzahl von wissenschaftlichen oder kommerziellen Anbietern bezogen werden können. </li><li> Rekonstituieren Sie lyophilisierte Primer in RNase / DNase freies Wasser in einem Arbeitsvorrat von 100 uM. </li></ol></li><li> Speicher PCR Primer bei -20 ° C. Verdünnen Sie 100 uM Primer Lager bis 10 uM Arbeits Lager für PCR-Reaktionen. </li></ol> 3. Bisulfite Spezifische PCR-Optimierung HINWEIS: Für Bisulfitumwandlung genomische DNA, eine Reihe von verschiedenen kommerziellen Kits für die Bisulfit-Umwandlung zur Verfügung. Wählen Sie den Kit oder Protokoll, das am besten für die geplante Experiment. &lt;ol&gt; <li> Verwenden Sie zwischen 200 ng bis 2 ug genomischer DNA. Für Optimierungsversuche, mehrere Konvertierungs Reaktionen, um eine ausreichende Bisulfit-konvertierter DNA haben für mehrere BS-PCR-Reaktionen. </li><li> Verwenden Sie kleine (zB 10 ul) Elutionsvolumina von Bisulfit-konvertierter DNA hohen DNA-Konzentrationen zu erhalten. HINWEIS: 1-2 ul der Bisulfit-konvertierter DNA reicht für Optimierung PCR-Reaktionen, wenn 1 &amp; mgr; g genomische DNA wurde für die Konvertierung Eingang verwendet. </li><li> Amplify Bisulfit-konvertierter DNA, die durch Bisulfit-spezifische PCR. BS-PCR-Reaktionen erfordern, mit einer Taq-Polymerase zur Amplifikation Bisulfit-konvertierter DNA. <ol><li> Setzen Sie die folgende Reaktion zur Zielverstärkungs Optimierung eines einzelnen Amplikon. Bei mehreren Proben, montieren Reaktionen in einer 96-Well-PCR-Platte. 25 ul 2x Reaktionspuffer 0,5 ul dNTP Mix 5 ul 10 uM Forward Primer (Final 1 uM) 5 ul 10 uM Reverse Primer(Final 1 uM) 2 ul Template Bisulfit-konvertierter DNA 0,4 &amp; mgr; l (5 U / ul) DNA-Polymerase 12,1 ul DNase freies Wasser (Final Reaktionsvolumen 50 ul) </li><li> Siegel PCR-Platte mit dem entsprechenden Klebstoff oder Heißsiegelfolie. </li><li> Zeigen Reaktion in geeigneter Thermocycler und verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen mit einem beheizten Deckel: <ol><li> Führen eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 10 min. </li><li> Denaturierung bei 95 ° C für 30 sec. </li><li> Glühen für 30 sec bei der spezifischen T m von Primern verwendet. Starten bei einer Glühtemperatur einige ° C unterhalb der T m des Primers Optimierungsreaktionen. HINWEIS: Best Glühtemperaturen kann auch mit einem Gradienten-Thermocycler, um einen Bereich von Temperaturen zu testen bestimmt werden. </li><li> Führen einer Verlängerung bei 72 ° C für 30 sec. Verlängern Sie die Verlängerungszeit für längere Amplikons. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3.2-3.3.3.4 35 Zyklen zutal für die erste Optimierung. Höhere Taktzahlen notwendig sein, sollte aber generell vermieden werden, um klonale Amplifikation, die Reaktions Artefakte schaffen zu verhindern. </li><li> Durchführen einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 7 min. </li><li> Halten Reaktionen bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Visualisieren Amplikons durch PAGE-Elektrophorese. Als Alternative kann ein Kapillarelektrophorese-DNA-Chips nach dem Protokoll des Herstellers. <ol><li> Mischungs 24 ul der PCR-Reaktion mit 6 ul 5x Ladepuffer auf Eis und Wirbel. </li><li> Auffüllen auf 1 l 1x TBE Laufpuffer durch Mischen von 200 ml von 5 x TBE Laufpuffer und 800 ml ddH 2 O. Verdünnter DNA-Leiter für eine Endkonzentration von 0,5 ug pro Vertiefung in ddH 2 O und Ladefarbstoff. </li><li> Last Wells mit 30 ul PCR-Reaktionen oder Leiter. </li><li> Die Elektrophorese bei 200 V für ~ 45 min. Stoppen Sie das Gel laufen, wenn das erste Farbfront das Ende des Gels erreicht. </li><li> Fleck des Gels mit 5 ug / mlEthidiumbromid, indem 5 &amp; mgr; l von 10 mg / ml in 100 ml ddH 2 O. Decken die gesamte Gel und lassen inkubieren ~ 5 min. </li><li> Bild das Gel über eine UV-Licht-Box oder multimodaler Bildwandler bei einer Anregungswellenlänge von 482 nm. </li><li> In Bezug auf die Leiter, die Größe und die PCR-Produkte bestimmen Spezifität der Reaktion mit der Suche nach anderen als der erwartete Fragment Größe mehrere Bänder (4A und C). </li></ol></li><li> Wenn optimale Bedingungen für die BS-PCR bestimmt worden sind, führen BS-PCR auf experimentellen Proben. <ol><li> Reinige Amplikons von Rest Primern und anderen Reaktionskomponenten. Führen Silikasäule Reinigung SPRI Kügelchen oder Gel-Basis clean-up und Quantifizierung. </li><li> Elute Amplikons in 30 ul TE-Puffer. </li><li> Quantifizieren Amplikons mit fluorimetrischen Test mit Herstellerprotokolle. </li><li> Wenn es mehrere Amplikons pro Probe, sie gemeinsam in gleichen Gewicht pro VolumenMengen und bei -20 ° C. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. NGS Bibliothek Vorbereitung und Bibliothek QC HINWEIS: BSAS NGS Bibliothek Zubereitung verwendet eine vereinfachte transposome vermittelten Protokoll mit Dual-Indexierung (siehe Materialliste für Details über Bibliothek Vorbereitung Kit-Auswahl). Dieses Verfahren liefert eine extrem schnelle und Hochdurchsatz-Route für die Konstruktion der Bibliothek, die bestätigt hat, und zeigt wenig bis gar keine Vorspannung in Bisulfitsequenzierung Anwendungen 16,19. Dual-Indizierung ermöglicht eine höhere Multiplex von Proben als Einzelteil. Andere Bibliothek Vorbereitung Stile möglich sein kann, aber nicht getestet wurden. <ol><li> Bereiten NGS-Bibliotheken aus BS PCR-Produkte in einer 96-Well-PCR-Platte. Verdünne Amplikons zu 0,2 ng / &amp; mgr; l für eine letzte Eingangsmasse von 1 ng, oder 5 ul 0,2 ng / &amp; mgr; l Verdünnung. Führen Sie eine Bereinigung der erzeugten Bibliotheken mit SPRI Perlen. Verwenden Sie 50 bis 90 &amp; mgr; SPRI Perlen zur Isolierung von Bibliotheken wit diesem Protokoll. Das Volumen des SPRI Perlen hängt von Zielgröße von Bibliothek und Zyklus Anzahl der gewünschten Sequenzierungsreaktionen. HINWEIS: Verwenden Sie ein Schüttler oder Platten Vortexer, um Perlen zu resuspendieren. <ol><li> Eluieren die Bibliotheken aus den Perlen und Transfer in ein neues 96-Well-Platte und die Dichtung mit der Heißklebefolie für die Lagerung bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Größe und Konzentration der Bibliotheken (4B und D). <ol><li> Führen Bibliotheken auf einem Kapillarelektrophorese DNA Schlichtechip nach Protokollen des Herstellers. <ol><li> Mit einer hohen Empfindlichkeit Kapillarelektrophorese DNA Assay, um die durchschnittliche Größe der detektierten Bibliothek Spitzen und eine Schätzung der Molarität nach Protokollen des Herstellers zu bestimmen. </li></ol></li><li> Quantifizierung Bibliotheken mittels qPCR unter Verwendung von Primern gegen die Adaptersequenzen in den erzeugten Bibliotheken durch Standards mit einer bekannten Konzentration bestimmt. <ol><li> Run qPCR WiederAktionen auf einer Echtzeit-Instrument mit den absoluten Quantifizierung Einstellungen nach Herstellerprotokolle. </li><li> Verwenden der Größe der Bibliothek und das molare Quantifizierung von qPCR, um die molaren Konzentrationen der Bibliotheken zu berechnen. </li></ol></li></ol></li><li> Verdünne Bibliotheken bis 4 nM mit 10 mM Tris-Cl mit 0,1% Tween-20 bei pH 8,5. Speicher-Bibliotheken in einer 96-Well-PCR-Platte mit Heißklebefolie verschlossen und bei -20 ° C. </li></ol> 5. Sequencing Libraries Mit einem Benchtop Sequencer <ol><li> Auftauen und bereiten Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Auftauen 4 nM Bibliotheken auf Eis. </li><li> Auffüllen auf 1 ml 0,2 N NaOH in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pool 4 nM Bibliotheken in gleichen Volumenmengen, wenn mehrere Bibliotheken zu verwenden. </li><li> Verdünnen und denaturieren gebündelt Bibliotheken nach den Anweisungen des Herstellers in die gewünschte endgültige molare Konzentration. <ol><li> Halten verdünnt und denaturierengebündelt Bibliothek auf Eis, bis Sie sie auf Reagenzkassette laden. </li></ol></li><li> Generieren Sie ein Musterblatt enthaltenden Probe Namen und entsprechenden Indexinformationen und geben nur erzeugen .fastq Dateien. <ol><li> Musterblatt laden in der entsprechenden Musterblatt-Ordner auf dem Sequenzer. </li></ol></li><li> In insgesamt 600 ul verdünnt und denaturierte Bibliothek in die Reagenzienkartusche in den entsprechenden Schacht. </li><li> Führen Sie die Sequenzierungsreaktionen bis zur Fertigstellung. </li></ol> 6. Methylierung Quantifizierung Datenanalyse HINWEIS: Es gibt mehrere Programme für NGS Datenanalyse einschließlich kommerziellen und Open Source zur Verfügung. Details zur Ausführung von Programmen kann mit jeder spezifischen Verpackung. Allgemeine Anweisungen an jeder Station zusammen mit den spezifischen Befehle für diese Software-Paket angegeben. (Siehe Materialliste für Details über Software im Sinne dieses Protokolls). <ol><li> Import .fastq.gz Dateien in entsprechenden seSequenzierung Analyse Pipeline beibehalten Qualitätswerte (Qscores) für den Einsatz in Lese Trimmen. (In diesem Beispiel Programm auswählen &quot;Import&quot; und wählen Sie die zur Erzeugung liest Sequenzierungsmethode. Wählen Sie .fastq.gz Dateien lesen zu importieren, und zu halten Qscores von .fastq Dateien für Lese Trimmen Anwendungen durch Abwahl &quot;Verwerfen Qualität Partituren&quot; unter &quot;Allgemeine Optionen &quot;. Wählen Sie einen Speicherort für die importierten liest, und wählen Sie&quot; Fertig stellen &quot;.) <ol><li> Trim und bewahren liest mit den folgenden Einstellungen in einem NGS Datenanalyse Pipeline. (Bei diesem Programm wählen Sie &quot;Trim Sequenzen &#39;unter&#39; NGS Core Tools&quot;, und wählen Sie das liest, um beschnitten werden.) <ol><li> Behalten Sie nur liest, das ≥ Q30 Partituren. (Bei diesem Programm wählen Sie &quot;Trimmen mit Qualitätswerte&quot; und stellen Sie die Grenze bis 0.001.) </li><li> Behalten Sie nur liest, die ≤ 1 mehrdeutig Nukleotid. (Bei diesem Programm wählen Sie &quot;Trim mehrdeutig Nukleotide&quot; und stellen Sie die&quot;Maximale Anzahl von Mehrdeutigkeiten&quot; zu 1. Wählen Sie einen Ort, um getrimmt speichern liest, und wählen Sie &quot;Fertig stellen&quot;.) </li></ol></li><li> Karte liest getrimmt auf die In-silico-Bisulfit umgewandelt Gen Referenz von 2,2. (Für das Beispiel-Software wählen Sie &quot;Karte Liest Referenz&quot; unter &quot;NGS Core Tools&quot;. Wählen getrimmt liest abgebildet werden, und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. Wählen Sie die konvertierten Referenzsequenz und wählen Sie &quot;keine Maskierung &#39;unter&#39; Referenz Maskierung &#39;. Wählen Sie&#39; als nächstes &#39;.) <ol><li> Weisen Sie eine Höchststrafe für Fehlanpassungen, Insertionen und Deletionen. Eingestellten Parameter, so dass 100% der Leselänge benötigt zur Karte mit 90% Sequenzidentität. Zum Beispiel Software, weisen einen Wert von 3 für Fehlanpassungen, Insertionen und Deletionen. Weisen Sie einen Wert von 1 für die Mindestbruchteil der Leselänge Referenz abgebildet und weisen einen Wert von 0,9 für die Mindestbruchteil der Identität zwischen mapped lesen und Referenz. </li><li&gt; Verwerfen oder ignorieren unspezifische liest den Referenz abgebildet. Diese liest, kann ebenso gut auf mehrere Regionen abzubilden. Zum Beispiel Software-Option &quot;Ignorieren&quot; unter &quot;Nicht-spezifische Spiel Handling&quot; und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. </li><li> Zur Ausrichtung Ausgabe zu erzeugen jede Probe als unabhängige Datei. Zum Beispiel Software, wählen Sie &quot;Create Standalone lesen Zuordnungen&quot; unter &quot;Ausgabeoptionen&quot; und &quot;Speichern&quot; unter &quot;Ergebnis Handling &#39;. Wählen Sie einen Ort, um die Lese- Zuordnung speichern und wählen Sie &quot;Fertig stellen&quot;. </li></ol></li><li> Führen Sie eine Variante ruft Workflow auf das zugeordnete liest. Für das Beispiel-Software, wählen Sie &quot;probabilistische Variante Erkennung&quot; unter &quot;Resequenzierung Analysis&quot;, wählen Sie die Lese Mapping analysiert werden, und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. Wählen Sie &quot;Ignorieren unspezifische Spielen&quot; unter &quot;Filter Lesen&quot; und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. <ol><li> Sicherzustellen, dass die Sequenz an einer depth von ≥ 1000 X, indem Sie den &quot;Mindestschutz&quot; unter &quot;Stellenwert&quot;, um 1000. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Variante Anruf bei Vorwärts- und Rückwärts vorhanden ist liest. Zum Beispiel Software, wählen Sie &quot;Require Präsenz in Vorwärts- und Rückwärts Ständen &#39;unter&#39; Variant Filter&quot; und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. </li><li> Export ausgerichtet, Variante namens Daten als kommentierte Tabelle. Zum Beispiel Software, wählen Sie &#39;kommentierte Tabelle &quot;unter&quot; Ausgabeoptionen &quot;und wählen Sie einen Speicherort für die Variantentabelle Datei zu speichern. Wählen Sie &quot;Fertig stellen&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Berechnen Sie 5-mC Prozentsatz unter Verwendung der Variante Frequenzen kommentierte CpG-Stellen in der Region von Interesse aus der Variantentabelle Datei. Die Frequenz von Cytosin an einer Referenz C in CG ist das 5-mC Prozentsatz. HINWEIS: Bei Verwendung Variante ruft Algorithmen für hoch methylierte CpG aus, tauschen CpG Cytosine mit Thymin. Dies wird identify die abgebildeten Cytosin als Varianten, was zu Cytosin Frequenz bei CpG ist. </li><li> Bestimmen Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad (BSC) durch zuerst Berechnen des Prozentsatzes C ist nicht in CpG-Stellen in der Referenz (C). Multiplizieren Sie den Anteil der nicht CpG C ist durch die Anzahl der zugeordneten (T mp) Gesamt t, und dividieren durch Gesamt-C ist bei der Bezugs Ts (C MPT) abgebildet. 100 minus der Frequenz berechnet das Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad (BSC) dieser Bibliothek (Gleichung 1). </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52488/52488eq1.jpg" /> Gleichung 1 Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad. HINWEIS: Während Säugergenomen enthalten sehr geringe Mengen an nicht-CpG-Cytosin-Methylierung (mit Ausnahme möglicherweise von Stammzellen 20), enthalten Pflanzengenome eine erhebliche Menge. Um Bisulfit-Umwandlungswirkungsgrad in diesen referenc bestimmene Genomen ist ein geeigneter Weg, um einen Teil des mitochondrialen Genoms oder Chloroplastengenom oder bekannten unmethylierte Genen in Pflanzen vorliegenden sequenzieren genome 21 und Berechnen Umwandlungseffizienz wie oben beschrieben. Bisulfitumwandlung Effizienz ≥98% in den meisten Fällen, mit der nicht umgesetzte C die potenziell aus der Nicht CpG-Methylierung.

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome-wide+bisulfite+sequencing+for+assessing+epigenetic+heterogeneity.">Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+endogenous+gene+controls+for+bisulphite+conversion+in+analysis+of+plant+DNA+methylation.">Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation.</a> Plant Methods. 7, 39 (2011).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Ivanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+hybrid+capture+of+bisulfite-converted+DNA+for+targeted+bisulfite+sequencing+of+174+ADME+genes.">In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).</li><li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine.">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BSAS ermöglicht konzentriert, präzise Quantifizierung der DNA-Methylierung bei hohen Durchsatzkapazitäten sowohl in Anzahl der Proben und die Anzahl der Ziele. Darüber hinaus bietet diese Bibliothek unter Anwendung transposome vermittelte tagmentation benötigt weniger Input-DNA ist schneller und enthält weniger Schritte als bei herkömmlichen Scheren und nachfolgende Adapter Ligationstechniken. Diese Verbesserungen gegenüber bestehenden Verfahren erlauben eine präzise Basis-Level-DNA-Methylierungsanalyse von jedem Ziel von Interesse. Darüber hinaus bietet BSAS eine neue Methode zur Bestätigung der interessierenden Bereiche (differentiell Methylierung Regionen (DMRs), CpG-Inseln, regulatorische Regionen) mit Hilfe des gesamten Genoms Bisulfit 22 oder 23 zu erfassen Ansätze, die identifiziert wurden. Mit orthogonalen Bestätigung Ansätze und mehr quantitativ präzise Methoden verbessert die analytische Strenge epigenomischen Studien. Die hohe Lesetiefe mit BSAS erreicht ermöglicht eine präzise Quantifizierung in einem engen Vertrauensintervall, erneutBeratung in präzise Quantifizierung 16. Darüber hinaus kann die Fähigkeit, viele Proben in einem einzigen Experiment führen Sie den Stichprobenumfang für Bestätigungen gesamten Genoms Methoden, die die statistische Aussagekraft erhöhen zu erhöhen; eine Schwäche vieler aktueller epigenetische Studien. Wichtig ist, bietet BSAS eine basenspezifische CpG Methylierung die Quantifizierung, die für die Erzeugung von testbaren Hypothesen für die epigenetische Forschung ermöglicht. Hypothesen wie erhöhte Methylierung an einer bestimmten Antwortelement führen zu einer verringerten Bindung eines spezifischen Transkriptionsfaktors führen. BSAS, kombiniert mit gekoppelten mRNA-Expressionsdaten, stellt ein Verfahren zur Gewinnung sowohl epigenetischen Regulation und mRNA-Expression in einem einzigen Stück Gewebe oder Zellpopulation. Doppelbestimmungen der Regulation und Expression erhöhen auch die wissenschaftliche Strenge und Auswirkungen der Ergebnisse. Kritische Schritte in der BSAS-Protokoll umfassen Primer-Design, Amplikon Optimierung und Bibliothek Generation /QC. PCR Vorspannung eingeführt werden, wenn Primer sind nicht richtig ausgelegt und verstärken auf verschiedenen Wirkungsgraden 8. Die Verwendung von Methylierungsstandards wie enzymatisch erzeugten 100% und 0% Cytosin methylierte Standards kann verwendet werden, um den Grad zu bestimmen, falls vorhanden, der Methylierung Quantifizierung bias, und ist eine geeignete Methodensteuerung bei der Quantifizierung Methylierungs 16. Ebenso sollte Sorgfalt bei der Optimierung der PCR-Reaktionen zur Erzeugung eines einzelnen hochwertigen Amplikon genommen werden. Wenn kein Amplikon vorhanden ist mit den vorgeschlagenen Leitlinien im Protokoll aufgeführt, sind Optimierungsschritte erhöhen PCR-Zyklus-Nummern oder bsDNA Eingangsmenge. Wenn es mehrere PCR-Produkte, einschließlich Primer-Dimere umfassen Optimierungsschritte abnimmt bsDNA Eingangsgrße, die Verringerung der PCR Primer molaren Eingangskonzentrationen zunehmende Glühtemperaturen oder Verringern PCR Zykluszahl. Eines oder eine Kombination dieser Optimierungsverfahren ergibt zufriedenstellende Ergebnisse, um eine einzige hig erzeugenh-Qualität Amplikon. Alternativ Neugestaltung Primer ist ein guter Ansatz für die Primer-Sets, die eine einzelne Amplicon nicht nachgeben müssen. Für Regionen, in denen Redesign ist nicht geeignet oder möglich ist, degenerieren Primer-Sets einschließlich Cytosin und Thymin ist an CpG-Stellen in Vorwärtsprimer und Adenin und Guanin ist an CpG-Stellen in umgekehrter Primer können zu arbeiten. Allerdings müssen diese Primersätze weitere Optimierung keine PCR Vorspannung auftritt, ein Verfahren außerhalb des Umfangs dieses Protokolls. Qualität Bibliotheken sind für den Erfolg von großer Bedeutung. Stellen Sie sicher, dass QC Maßnahmen durchgeführt, um Größe, Qualität und Quantität der Bibliotheken, bevor Sequenzierung zu bestimmen. Sequenzierungsreaktionen sind anfällig für Fehler bei Eingabe von niedriger Qualität Bibliotheken. Bias in Methylierung Quantifizierung kann, indem sichergestellt wird, dass die Methylierung Frequenzen sowohl in Vorwärts- als vorhanden sind und Reverse-Sequenzierung liest gemildert werden. Darüber hinaus sollte die Qualität Partituren von Basen Angleichung an CpG ≥Q30 für Hoch Zusammenarbeit seinnfidence in Quantifizierung. Während andere bisher wenig bis keine Verzerrungen bei tagmentation Reaktionen von Bisulfit-konvertierter DNA 19 gezeigt, wodurch die oben beschriebenen Metriken können zur Bestätigung der niedrigen Bias-Methylierung Quantifizierung. BSAS misst derzeit Methylierung an CpG-Stellen wird jedoch zukünftige Erweiterungen dieses Verfahrens Doppelbestimmungen von CpG 5-HMC unter Zusatz von experimentellen Schritte Unterscheiden zwischen 5-mC und 5-hmC wie die Einführung von Kalium perruthenat vor Bisulfit-Umwandlung von 24 zu ermöglichen. Dies wird die Auswirkungen der BSAS-Dienstprogramm, indem für gepaarte Methylierung um Genexpression regulatorische Rolle von DNA-Methylierung bestimmen zu erhöhen, sowohl 5-mC und 5-hmC und Expressionsdaten. Transposome vermittelte Bibliothek Herstellung von PCR-Amplicons nicht verringerten Sequenzierung Tiefe an den Enden der amplifizierten Bereiche führen. Daher sollten die Regionen von hohem Interesse konstruiert werden, um in der Mitte des Amplikons befinden. Wieimmer, weil BSAS erzeugt Sequenzierung ausgelesen Tiefen&gt; 1000 X, die quantitative Genauigkeit von 5-mC Messungen in der Nähe der Enden der amplifizierten Bereiche hoch bleibt.

Es hat über ein halbes Jahrhundert seit dem ersten Bericht von natürlich vorkommenden DNA-Modifikationen in Form von Cytosin-Methylierung 1 gewesen. Cytosin-Methylierung ist ein modifiziertes Cytosin Nukleotidbase wo die 5. Kohlenstoff auf dem Basisring hat eine Methylgruppe (5-MC), die am häufigsten in dem CpG-Dinukleotid-Motiv in Säugergenomen auftritt. Die funktionale Anwesenheit von 5-mC in Gen-Promotoren in der Regel mit Transkriptionsrepression verbunden, während der Abwesenheit ist mit Transkriptionsaktivität 2 verbunden. Enorme Fortschritte in unserem Verständnis von der Rolle der DNA-Methylierung in der Entwicklung 3. Transgeneration Ausbreitung von epigenetische Profile 4, Krebs Pathogenese 5,6, und eine Reihe von anderen Forschungsbereichen vorgenommen. Viele dieser Fortschritte haben in den letzten Jahren kommen, wie neue Methoden entwickelt, um die DNA-Methylierung 7 Profil. Mit dem Aufkommen undPopularisierung der Next-Generation-Sequencing (NGS) Techniken gibt es nun eine Reihe von Methoden zur DNA-Methylierung für einen ganzen Genoms oder große Bereiche eines Genoms 8 Profil. Diese Ansätze die Möglichkeit offen, Entdeckung Studien, die DNA-Methylierungsmuster und Unterschiede in der DNA-Methylierung zu quantifizieren. Zusätzlich zu diesen Hypothesen-Erzeugungs Ansätze besteht ein erheblicher Bedarf für eine gezielte / Hypothesentests DNA Methylierung Quantifizierungsverfahren. Pyrosequenzierung methylierungsspezifischen PCR und direkte Sanger-Sequenzierung von Bisulfit umgewandelte DNA waren die am häufigsten verwendete Verfahren zur Analyse von Zielregionen (das heißt, eine Promotorregion von einem Gen oder einer CpG-Insel), 9-12. Alle diese Verfahren beruhen auf Bisulfitumwandlung, eine chemische Reaktion, bei der Deaminierung unmethylierte Cytosin sind in Uracil umgewandelt, während methylierte Cytosin bleiben intakt 13,14. PCR-Amplifikation von bisulfite-konvertierter DNA ergibt Ersatz von Uracil mit Thymin 15 so dass der Differenz Methylierung als Basis Differenz ausgelesen. Während sehr nützlich, die Grenzen zu diesen Verfahren sind geringe quantitative Genauigkeit, kurze Leselänge und geringen Probendurchsatz. Um diese Einschränkungen zu adressieren wir eine Methode haben wir Bisulfit-Sequenzierung Amplicon (BSAS) 16 bezeichnet wird entwickelt. Das Ziel dieser Methode ist es, in der Lage, Ziel genomischen Regionen von Interesse in einer Vielzahl von Proben mit einer hohen quantitativen Genauigkeit zu analysieren. BSAS nutzt Elemente der bestehenden Methoden (Bisulfitumwandlung und regionsspezifische PCR-Amplifikation) und kombiniert sie mit einfachen nächsten Generation Bibliothekskonstruktion (transposome vermittelte) 17 und Tisch NGS 18 (Abbildung 1). Dieser Ansatz sorgt für eine quantitative und eine höhere Durchsatzverfahren, um die Cytosin-Methylierung in einer beliebigen Region von Interesse zu untersuchen. Hier präsentieren wir dieVerfahren im Detail und beschreibt Methoden für die Fehlersuche und die Qualität der Überprüfung der BSAS-Prozess.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanlyzer</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech PCR plate 96&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>semi-skirted</td></tr><tr><td>Heatsealing Film</td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>Heatsealing Foil</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>Heat Sealer</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 &amp;#956;l Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &amp;#956;l Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1,000 &amp;#956;l Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html&quot;&gt;Nextera XT DNA Sample Preparation Kit&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html&quot;&gt;Nextera XT Index Kit&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 indexes</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/systems/miseq.html&quot;&gt;MiSeq Desktop Sequencer&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html&quot;&gt;MiSeq Reagent Kit v2&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 cycles</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex 96-well PCR system</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% TBE DNA gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10-well</td></tr><tr><td>Novex TBE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR system</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td>384-well block</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td><td>Molecular Devices/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Beads</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Software for methylation pipeline</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-well Full-Skirted Plate, Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR Seal</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNA Polymerase</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS liest richtig umgesetzte Referenzsequenz abgeglichen werden 5 ähneln. CpG eindeutig identifiziert werden können und Methylierungszustände können durch die Beobachtung Basis Anrufe CpG-Stellen in das zugeordnete liest geschätzt werden. Zum Beispiel mit Methylierung steuert, 0% Methylierung wird in alle Lesevorgänge auf CpG-Stellen enthalten, Ts (5A) abgebildet führen. 100% Methylierung Kontrollen ergeben alle Lesevorgänge abgebildet liest CpG enthaltende C ist (5B). Quantifizierung von Cytosin Frequenz (C / C + T) an CpG ergibt die Methylierung Frequenz in der ursprünglichen Probe. Eine repräsentative Standardkurve von Gesamtgenom Methylierung Kontrollen (n = 3 / Methylierungsverhältnis) erzeugt zeigt Linearität Methylierung Quantifizierung sowie Präzisions in Quantifizierung an jedem Methylierungsverhältnis (Abbildung 6). Als ein Beispiel für dieses Verfahren insgesamt wurden RNA und DNA co-iso<html> rechnet aus Mauskleinhirn und Retina (n = 4 / Gruppe). Rhodopsin Ausdruck, wahlweise in Netzhautgewebe exprimiert wird, wurde mit qPCR gemessen. Expression wurde nur in der Netzhaut (7A) detektiert. Verwendung BSAS wurden CpG Methylierungsstufen in Rhodopsin Promotorregion quantifiziert. Kumulative Methylierungsstufen in der Promotor-Region waren im Cerebellum von&gt; 80% im Vergleich zu &lt;15% in der Netzhaut (p &lt;0.001, t-parametrischen Test) (7B). BSAS Methylierung Quantifizierung profitiert von ortsspezifischen Methylierungs Quantifizierung und Methylierung Niveaus können auf einem CpG spezifisch in einem bestimmten Genomregion verglichen werden. Im Vergleich zu Netzhautproben (p &lt;0.001, t-parametrischer Test bei jeder CpG-Bereichs) (7C) CpG Methylierungsstufen in Rhodopsin Promotor waren signifikant höher in Kleinhirnproben. 1highres.jpg &quot;/&gt; Fig. 1: Schematische Darstellung der BSAS Verfahren Bei diesem Verfahren wird die genomische DNA Bisulfit umgewandelt unmethylation Cytosine zu Uracil zu modifizieren. Damit kann bei der PCR diese Uracile werden Thymin verändert. PCR-Amplifikation gegen Regionen von Interesse gerichtet und sehr bereichert nur für diesen Sequenzen. Die daraus resultierenden PCR-Produkte werden in Dual-Bibliotheken indiziert durch eine einfache tagmentation Verfahren hergestellt. Anschließend werden die Bibliotheken auf einem Benchtop nächste Generation Sequencer sequenziert und die Sequenzlesevorgänge werden auf die in silico umgewandelt Referenzsequenz und Prozent-Methylierung von Cytosin ist in einem basenspezifische Weise bestimmt abgebildet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Abb. 2: In silico Bisulfitumwandlung der Region von Interesse Jede Region von Interesse von jedem genomischen Referenz kann Selec seinten für die in silico Bisulfitumwandlung. Non-CpG-Cytosinen mit Thymin in der Referenzsequenz ersetzt. CpG Cytosine bleiben Cytosine in der Bisulfit umgewandelt Referenz. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Abb. 3: Primer Platzierung Bisulfit-PCR-Primer gegen eine in silico Bisulfit gestaltet umgeReferenzSequenz. Primer sind so gestaltet werden, dass sie CG-Dinukleotide nicht überlappen oder CG Dinukleotide ausgelegt benachbart. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Beispiele für hohe und schlechte Qualität PCR-Produkte und Sequenzierungsbibliotheken Vertreter Elektropherogramm Spuren und Gel zeigen (A) ideal Amplikon für transposome vermittelte Bibliothek Generation mit einem einzigen hoch.Konzentration Produkt. (B) Bibliothek aus dieser Amplikons erzeugt eine hohe Konzentration und sogar Größenverteilung. (C) Schlechte Qualität PCR-Produkte können geringe Größe, Konzentration sein und enthalten mehrere Produkte und / oder Primer-Dimere. Diese schlechte Qualität Amplikons wird (D) führen gescheitert Bibliothek Generation mit geringer Konzentration und geringen Größenverteilung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: Beispiele von Sequenzierungs Ausgänge von Methylierung Kontrollen. (A) In silico umgewandelt Referenz Sequenzierung mit CpG-Stellen rot markiert. 0% Methylierung Steuerung abgebildet liest die ausgewählte Region zeigt Thymine (Gier Highlight) Mapping an CpG-Stellen. (B) 100% Methylierung Steuerung abgebildet liest zeigen Cytosin ist (blaue Markierung) Mapping an CpG-Stellen. Abb. 6: Die Methylierung Quantifizierung in einer Reihe von Methylierung steuert ganze Genom-Methylierung Kontrollen an den Methylierungsverhältnisse (n = 3 / Ratio) von 0% bis 100% gemischt wurden mit BSAS quantifiziert. Trägt man die Quantifizierung der erwarteten quantifizierten Vergleich zeigt die Linearität der Methylierung Steuer Quantifizierung. Über alle Kontrollen gab es hohe Präzision bei der Methylierung Quantifizierung. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Abbildung 7: Beispiel der gekoppelten DNA-Methylierung und Genexpressionsanalyse von Gewebeproben. (A) Rhodopsin relativen mRNA-Expression von Maus-zerebelläre und Netzhautgewebe. (B) Rhodopsin durchschnittliche Promotormethylierung von BSAS quantifiziert zwischen cerebellar und retinale DNA (*** p &lt;0.001, t-parametrischen Test). &lt;strong&gt; C) CpG ortsspezifische Methylierung Niveaus in Rhodopsin-Promotor (-244 bis 6, bezogen auf Transkriptionsstartstelle [TSS]) in der Maus Kleinhirn und Netzhaut-DNA.

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Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

37.0K Aufrufe.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Serie: Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Forschung

Genetik

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

Eine Ratte Methyl-Seq-Plattform um epigenetische Veränderungen im Zusammenhang mit Stress Exposition zu identifizieren

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Biochemie

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Neurowissenschaften

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of DNA samples. It is resourceful, requires small amounts of DNA, and takes around 4&#8211;5 h of hands-on work. In the presented technique, DNA samples are first denatured then hybridized to probes that target DNA at either methylated or reference sites as a control. Hybridized DNA is separated into parallel reactions, one undergoing only ligation and the other undergoing ligation followed by HhaI-mediated digestion at unmethylated GCGC sequences. The resultant DNA fragments are amplified by PCR and separated by capillary electrophoresis. Methylated GCGC sites are not digested by HhaI and produce peak signals, while unmethylated GCGC sites are digested and no peak signals are generated. Comparing the control-normalized peaks of digested and undigested versions of each sample provides the methylation dosage ratio of a DNA sample. Here, MSPA is used to detect the effects of osteosarcoma-derived extracellular vesicles (EVs) on the methylation status of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) in mesenchymal stem cells. LINE-1s are repetitive DNA elements that typically undergo hypomethylation in cancer and, in this capacity, may serve as a biomarker. Ultracentrifugation is also used as a cost-effective method to separate extracellular vesicles from biological fluids (i.e., when preparing EV-depleted fetal bovine serum [FBS] and isolating EVs from osteosarcoma conditioned media [differential centrifugation]). For methylation analysis, custom LINE-1 probes are designed to target three methylation sites in the LINE-1 promoter sequence and seven control sites. This protocol demonstrates the use of MSPA for LINE-1 methylation analysis and describes the preparation of EV-depleted FBS by ultracentrifugation.

Described here is the use of a methylation-specific probe amplification method to analyze methylation levels of LINE-1 elements in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Ultracentrifugation, a popular procedure for separating extracellular vesicles from fetal bovine serum, is also demonstrated.

LINE-1 Methylierungsanalyse in mesenchymalen Stammzellen, die mit Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

Genomweite Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Krebsforschung

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Biologie

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...