This work was supported by the Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (to KP) and a Neuromuscular Research Partnership Program grant from the CIHR, the ALS Society of Canada, and Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) to CK and FMR. Additional support was also provided by the ALS Society of America (57969). We would like to thank Dr. R. Keith Humphries from the Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada and the staff at the Simon Fraser University Animal Care Unit.

HINWEIS: Ethikerklärung: Dieses Protokoll wurde überprüft und von der Animal Care Committee der Simon Fraser University zugelassen (UACC; erlauben Zahlen 1037K-12 und 1060K-03) und ist in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care, der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der EWG Richtlinie. 1. Spezielle Überlegungen HINWEIS: Busulfan ist zytotoxische. Behandeln und entsorgen Sie nach dem Sicherheitsdatenblatt und institutionellen Richtlinien. <ol><li> Führen Sie alle Techniken aseptisch in einer Sterilbank. </li><li> Sterilisieren von Instrumenten vor der durch Wickeln in einer geeigneten Verpackung, beispielsweise einer abziehbaren Verpackung und Autoklavieren zu verwenden. </li><li> Während das Risiko für eine Infektion mit niedriger Busulfan Anlage gegenüber Bestrahlung, Griff Tieren nur in einer laminaren Strömungshaube für die ersten 2 Wochen nach der Transplantation. </li></ol> 2. KonditionierungEmpfänger Mäuse <ol><li> Verdünne Busulfan bis 3 mg / ml mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ml. HINWEIS: Es ist wichtig, um eine frische Verdünnung von Busulfan kurz vor jeder Tag der Injektion verwendet werden. </li><li> Verwalten Sie 20 mg / kg des verwässerten Busulfan auf Empfängermäuse über IP-Injektion täglich. </li><li> Täglich wiederholen IP-Injektionen von 20 mg / kg Busulfan, bis zu einer Gesamtdosis von 60-100 mg / kg abgegeben wurde (dh für eine 80 mg / kg Gesamtdosis verabreichen 20 mg / kg Busulfan für 4 aufeinanderfolgende Tage). </li></ol> 3. Isolierung von Spenderknochenmarkzellen HINWEIS: Dieses Protokoll wurde erfolgreich zur Isolierung und Vorbereitung BM-Zellen von bis zu 5 Spendermäusen eingesetzt. Typischerweise wird die Zellausbeute pro Maus etwa 30 bis 40.000.000 BMDCs, die ausreicht, um 12 bis 16 Empfängermäuse verpflanzen ist. Wenn mehr Donormäusen benötigt das Protokoll müssen entsprechend angepasst werden. <ol><li> Nach dem letzten Tag der Busulfan Anlage EuthAL TEN ein GFP Spendermaus (1-6 Monate) mit CO 2 (oder von anderen Euthanasie-Verfahren bei Hochschule angenommen). Zur Vermeidung von Transplantat Komplikationen verwenden syngenen Spendern, die das gleiche Geschlecht wie die Empfänger sind. </li><li> Spray-Maus mit 70% Ethanol. Fahrstuhl Haut an den Bauch und mit chirurgische Scheren einen Einschnitt durch die Haut aus der Bauchhöhle bis das Bein auf die Knöchel. Halten Sie den Fuß fest ziehen Sie die Haut vom Knöchel zur Hüfte Freilegung der Beingewebe. </li><li> Schneiden Sie Muskel- und Fettgewebe aus dem Oberschenkelknochen, das Hüftgelenk aus. </li><li> Langsam nach unten auf den Fuß, das Bein zu verlängern, drücken Sie die Schere gegen das Hüftgelenk. Schneiden Sie gerade über dem Kopf des Oberschenkelknochens kümmert sich nicht um den Oberschenkelknochen selbst geschnitten. </li><li> Zur Aufrechterhaltung der Sterilität, halten Sie das Bein mit dem Fuß, und reinigen Sie alle verbleibenden Gewebe von den Knochen durch Reiben der Knochenoberfläche mit autoklaviert Gewebe. </li><li> Trennen Sie die Oberschenkel und Schienbein durch Schneiden durch das Kniegelenk undlegen Sie das Femur in einer Kulturschale mit steriler PBS. Auf Eis inkubieren. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie das Wadenbein, indem an den Stellen, wo das Wadenbein verbindet sich mit dem Schienbein. Legen Sie die Tibia in der Kulturschale mit dem Oberschenkelknochen und auf Eis inkubieren. </li><li> Die Schritte 3,2-3,7 für das andere Bein, und gegebenenfalls weitere Spendermäusen. Nach der Entfernung der Knochen, sterilisieren chirurgische Instrumente mit einem heißen Perle Sterilisator oder verwenden Sie eine neue Reihe von sterilen Instrumente für die weiteren Schritte. </li><li> Für den Oberschenkelknochen, halten Sie die Oberschenkel mit einer Pinzette und mit chirurgische Scheren sorgfältig &quot;Rasur&quot; die distalen Enden der Knochen. So wenig von den Knochen wie nötig, um die BM Höhle freizulegen. </li><li> Füllen Sie eine Spritze mit 3 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 23 G Nadel. Vorsichtig trug die Nadel in die BM Höhle und spülen Sie das BM in eine sterile Petrischale. Achten Sie darauf, die Markhöhle mit der Nadelspitze zu kratzen, um die Entfernung aller gewünschten Zellen zu gewährleisten. Nach der Extraktionsicherzustellen, dass der rote BM nicht mehr sichtbar ist und der Knochen wird jetzt weiß. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,9-3,10 für nachfolgende Oberschenkelknochen, die Bündelung all der BM in der gleichen Kulturschale. </li><li> Für die Schienbeine, halten Sie die Tibia mit einer Pinzette vorsichtig &quot;Rasur&quot; das Ende, wo das Schienbein bis zum Knie, um den BM Höhle aussetzen befestigt. Machen Sie einen zweiten Schnitt entlang der Knochen, wo die sichtbaren roten BM endet. </li><li> Füllen Sie eine Spritze mit 3 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 25 G Nadel. Schieben Sie die Nadel in die BM Hohlraum (vom Ende, die bis zu den Knien befestigt war) und spülen Sie das BM in der Kulturschale mit dem BM aus den Oberschenkelknochen. Kratzen die Wände des Hohlraums BM mit der Nadel, um alle Zellen zu entfernen. Nach der Extraktion zu gewährleisten, dass die rote BM nicht mehr sichtbar ist und der Knochen wird jetzt weiß. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 3,12 bis 3,13 für nachfolgende tibiae, die Bündelung all der BM in der gleichen Kulturschale. </li><li> Sanft verreiben die BM mit einer 1 ml Pipettenspitze, um die c distanzierenEllen. </li><li> Passieren die Zellsuspension durch ein 40 &amp; mgr; M Korbfilter in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Schale mit PBS, um alle verbleibenden Zellen und übertrage diese durch den Filter in dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in 3 ml Erythrozyten Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min. </li><li> Hinzufügen ~ 30 ml sterilem PBS, die Lysepuffer quenchen. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 1 ml sterilem PBS. Halten Sie auf dem Eis. </li><li> Nehmen ein kleines Aliquot des Zellhomogenats mit PBS verdünnt (1: 100 für 1 Maus, 1: 200 für die 2-Mäuse, etc.), um die Anzahl der Zellen zu quantifizieren, unter Verwendung eines Hämocytometers. </li><li> Verdünne die Zellsuspension auf 8 x 10 6 Zellen / ml und Inkubation auf Eis bis zur Injektion. </li></ol> 4. Knochenmarktransplantation <ol><li> Fill ein 0,5-ml-Spritze (mit einer 28 G Nadel Insulin) mit 300 ul verdünnten Zellsuspension für jede Maus injiziert werden. Seien Sie sicher, dass alle in der Spritze Luftblasen zu entfernen. </li><li> Platzieren Sie die Maus Käfig mit den konditionierten Empfängermäuse auf einem Heizkissen und lassen Sie die Schwanzvenen zu erweitern. </li><li> Nehmen Sie eine Empfängermaus und in die Rückhalteeinrichtung. Wischen Sie den Schwanz mit chirurgischen Gaze mit 70% Ethanol eingeweicht. </li><li> Halten Sie das Heck und mit der Fase nach oben, sanft die Nadel in eine der seitlichen Schwanzvenen und injizieren Sie die Zellsuspension. </li><li> Halten chirurgischer Gaze auf die Injektionsstelle, bis die Blutung aufhört vor dem Einführen der Maus in einen neuen sauberen Käfig. </li></ol> 5. Schätzung der Umfang der BM Chimärismus HINWEIS: Chimärismus Ebenen sind in der Regel variable im peripheren Blut nach 1 Woche nach der KMT, und als solche Chimärismus Ebenen werden in der Regel geschätzt mindestens 2 Wochen nach der KMT. Ebenen der chimerism sollte&gt; 80% GFP + Zellen im peripheren Blut in 3-4 Wochen erreichen nach der KMT. <ol><li> Bereiten FACS Puffer (2 mM EDTA + 2% fötalem Rinderserum in PBS). HINWEIS: FACS-Puffer bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einem Halterohr und rasieren Sie das Fell auf dem hinteren Bein, um die laterale Vena saphena aus. </li><li> Dünn Mantel das Bein mit Vaseline und durchbohren die Vena saphena mit einer 25 G-Nadel. </li><li> Sammeln etwa 50 ul Blut mit Heparin beschichteten Kapillarröhrchen. Füge das Blut in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml FACS-Puffer. Mischen Sie das Rohr durch Umdrehen und Lagerung auf Eis. </li><li> Halten chirurgischer Gaze auf die Injektionsstelle bis die Blutung aufhört, bevor er Maus wieder in den Käfig. </li><li> Zentrifugieren der Blutproben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in 500 ul Erythrocyten-Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min. </li><li> 1 ml FACS-Puffer, um die Lysepuffers quenchen. </li><li> Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Führen Sie eine zweite Lyseschritt in 500 ul Erythrozyten Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min. </li><li> 1 ml FACS-Puffer, um die Lysepuffers quenchen. </li><li> Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. Überprüfen Sie, ob das Pellet ist jetzt weiß. HINWEIS: Wenn das Pellet noch rot angezeigt wird, kann ein zusätzlicher Lyse, bevor Sie mit dem nächsten Schritt benötigt. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in 300 ul FACS-Puffer und Quantifizierung GFP + -Zellen mittels Durchflusscytometrie (ANMERKUNG: An diesem Punkt jede gewünschte Immunfärbung der Zellen kann durchgeführt werden unter Verwendung von Standardtechniken vor der Durchflusszytometrie-Analyse). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Busulfan Anlage ermöglicht die Erzeugung von High-Level BM Chimärismus in Mäusen, die mit hämatopoetischen Zellen, die leicht nachweisbar sind. Diese Konditionierung kann ohne die Notwendigkeit für Bestrahlungsanlagen durchgeführt werden. Außerdem ist die Myelosuppression mit den Dosen von Busulfan in diesem Protokoll umrissen gut verträglich Minimierung toxischer Nebenwirkungen von myeloablativen Dosis der Bestrahlung verursacht werden, und somit kann eine weitere geeignete Technik zur BM Chimärismus in junge,...

Recently, there has been considerable interest in the roles of microglia and bone marrow (BM)-derived cells (BMDCs) in the central nervous system (CNS), both during disease as well as with normal aging. Microglia, the resident immune cells of the CNS, are now known to develop in the CNS following the entry of primitive myeloid progenitors during embryogenesis1. Microglia retain aspects of their myelomonocytic lineage well into adult life. While evidence suggests that the contribution of BMDCs to the microglial pool is minimal in healthy adult animals1, the role BMDCs play in the progression of various neurodegenerative diseases remains unclear. This uncertainty is compounded by the fact that it is difficult to distinguish BMDCs that accumulate within the CNS from endogenous resident microglia, as no universally accepted discriminating immunohistochemical marker has been identified. In order to monitor BMDCs in vivo, we employ a BM transplantation (BMT) protocol whereby endogenous BM cells of a recipient mouse are replaced with those of a donor mouse ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the &#946;-actin promoter. This protocol permits the determination of both the localization and morphology of GFP+ BMDCs within the recipient mouse using immunohistochemistry, and facilitates further characterization of these cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) followed by subsequent biochemical assays. 
For a successful BMT, recipient BM cells need to be ablated (termed myeloablation) in order to generate niche space within the recipient BM to allow for donor cell engraftment. Often, myeloablation is achieved using total body gamma irradiation which induces double strand breaks in DNA that leads to cell death, particularly in actively dividing cells such as hematopoietic progenitor cells2,3. The irradiation protocols are done to induce sufficient BM cell death such that animal lethality results if the recipient animal does not achieve adequate donor cell engraftment from BMT (so called &#8216;lethal irradiation&#8217;). However, irradiation requires a specialized facility and equipment, along with veterinary and animal husbandry resources not available to researchers at all institutions. Furthermore, myeloablative irradiation can cause potentially lethal damage to other tissues, and due to immunosuppresion, irradiated animals are more susceptible to secondary infections3. As such, reduced intensity conditioning (so called &#8216;RIC&#8217; protocols) regimens have been developed that are intended to minimize potentially toxic side effects of the conditioning protocol in patients, particularly for use in at risk populations such as children and the elderly4. 
Some RIC protocols rely upon chemotherapeutics such as busulfan in order to condition the BM compartment. Busulfan is a bifunctional DNA alkylating agent often used clinically as an alternative to irradiation5,6. Notably, busulfan can be safely administered to mice by intraperitoneal (IP) injection and does not require the specialized facilities and equipment necessary to irradiate mice. Busulfan conditioning has been used extensively in our lab7, as well as in several other recent publications8&#8211;11. When doses of 60-100 mg/kg are employed, high degrees of stable chimerism (>80% GFP+ cells) can be established in the peripheral blood and BM7. Importantly, at these doses myeloablation is not complete and as such mice are able to survive without receiving support BM cells (K. Peake, J. Manning, C. Lewis, and C. Krieger, unpublished observations). Moreover, with myelosuppressive busulfan conditioning there is rapid reconstitution of peripheral blood myelomonocytic cells by donor cells. However, the replacement of peripheral blood lymphocytes by donor cells is slower, highlighting the lack of immunosuppression that occurs with 60-100 mg/kg doses of busulfan compared to total body irradiation7. 
We have successfully used busulfan-induced chimerism to investigate BMDCs in wild-type mice, as well as in mouse models of the neurodegenerative disorders amyotrophic lateral sclerosis (ALS)7 and Alzheimer disease. It has been observed that under certain conditions significant numbers of GFP+ BMDCs accumulate within the CNS7,12. Importantly, like myeloablative conditioning with irradiation, busulfan conditioning followed by BMT is sufficient to allow for GFP+ BMDC accumulation within the CNS in both wild-type mice, and mice with neurological disorders7&#8211;11. As a major obstacle in treating neurodegenerative disorders is the ability to get therapeutic molecules from the circulation into the CNS where they can exert beneficial effects, this raises the possibility that BMDCs could be engineered to express therapeutic molecules, and subsequently used as a vehicle to deliver therapeutics to the CNS of busulfan conditioned recipients, a mechanism we are actively investigating. Although we have found that myeloablative conditioning with irradiation leads to greater accumulation of GFP+ BMDCs in the CNS compared to busulfan conditioning7, irradiation may have considerable toxicity in patients with neurodegenerative disorders and in murine models of CNS disease.
While we, and many others, have used BMT models to study BMDCs in neurodegenerative disorders, the ability to largely replace the BM compartment of a recipient mouse with a distinctly identifiable population of BM cells is an invaluable tool for studying various aspects of the hematopoietic system. This includes a wide array of research topics such as hematopoietic lineage development, leukemia, organ transplantation, graft-versus-host disease, and immunobiology.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:224px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Busulfex</td>
			<td style="width:224px;">Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DIN 02240602</td>
			<td>Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10492-01</td>
			<td>Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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busulfan as a myelosuppressive agent for generating stable high-level bone marrow chimerism in mice

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct biomarker isolated from donor mice. This technique allows for identification of donor-derived hematopoietic cells within the recipient mice, and can be used to isolate and characterize donor cells using various biochemical techniques. BMT typically relies on myeloablative conditioning with total body irradiation to generate niche space within the BM compartment of recipient mice for donor cell engraftment. The protocol we describe here uses myelosuppressive conditioning with the chemotherapeutic agent busulfan. Unlike irradiation, which requires the use of specialized facilities, busulfan conditioning is performed using intraperitoneal injections of 20 mg/kg busulfan until a total dose of 60-100 mg/kg has been administered. Moreover, myeloablative irradiation can have toxic side effects and requires successful engraftment of donor cells for survival of recipient mice. In contrast, busulfan conditioning using these doses is generally well tolerated and mice survive without donor cell support. Donor BM cells are isolated from the femurs and tibiae of mice ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP), and injected into the lateral tail vein of conditioned recipient mice. BM chimerism is estimated by quantifying the number of GFP+ cells within the peripheral blood following BMT. Levels of chimerism&nbsp;>80% are typically observed in the peripheral blood 3-4 weeks post-transplant and remain established for at least 1 year. As with irradiation, conditioning with busulfan and BMT allows for the accumulation of donor BM-derived cells within the central nervous system (CNS), particularly in mouse models of neurodegeneration. This busulfan-mediated CNS accumulation may be more physiological than total body irradiation, as the busulfan treatment is less toxic and CNS inflammation appears to be less extensive. We hypothesize that these cells can be genetically engineered to deliver therapeutics to the CNS.

Die Verabreichung von 60-100 mg / kg Busulfan im allgemeinen gut von Mäusen gut vertragen. Doch in der Regel Tiere, Gewicht zu verlieren während der Konditionierungsphase (~ 5-10%) und damit die Nahrung muss unter Umständen mit Leckereien wie bestrahlt Sonnenblumenkerne zu essen zu fördern ergänzt werden. Ebenen der Chimärismus von&gt; 80% GFP + Zellen im peripheren Blut und BM konsequent erreichbar mit 60 bis 100 mg / kg Busulfan 7 sein. Unser Labor hat erfolgreich dieses Protokoll, mit dem über 100 c...

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Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.

Busulfan als myelosuppressiven Agenten zur Erwirtschaftung stabiler Hochrangige Knochenmark Chimärismus bei Mäusen

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

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Research

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Medicine

13.1K Aufrufe.  Simon Fraser University. We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.