This work was supported by the Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (to KP) and a Neuromuscular Research Partnership Program grant from the CIHR, the ALS Society of Canada, and Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) to CK and FMR. Additional support was also provided by the ALS Society of America (57969). We would like to thank Dr. R. Keith Humphries from the Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada and the staff at the Simon Fraser University Animal Care Unit.

REMARQUE: éthique Déclaration: Ce protocole a été examiné et approuvé par le Comité de l&#39;Université Simon Fraser de protection des animaux (UACC; numéros de permis 1037K-12 et 1060K-03) et est en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux, le Guide NIH pour la directive du Conseil de la CEE soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, et. 1. Considérations particulières NOTE: Le busulfan est cytotoxique. Manipuler et éliminer conformément à la fiche de données de sécurité matériel et directives institutionnelles. <ol><li> Effectuer toutes les techniques de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire. </li><li> Stériliser les instruments avant de les utiliser en l&#39;enveloppant dans un matériau d&#39;emballage approprié, comme un paquet de pelage, et autoclave. </li><li> Bien que le risque d&#39;infection est plus faible avec conditionné busulfan par rapport à l&#39;irradiation, manipuler les animaux que dans une hotte à flux laminaire pour les 2 premières semaines suivant la transplantation. </li></ol> 2. Conditionnement dessouris receveuses <ol><li> Diluer le busulfan à 3 mg / ml avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). NOTE: Il est important de prendre un nouveau dilution de busulfan juste avant d&#39;utiliser chaque jour de l&#39;injection. </li><li> Administrer 20 mg / kg de busulfan diluée à souris receveuses par injection IP quotidienne. </li><li> Répéter les injections quotidiennes d&#39;IP de 20 mg / kg busulfan jusqu&#39;à une dose totale de 60 à 100 mg / kg a été livré (ce est à dire, pour / kg une dose totale de 80 mg, administrer 20 mg / kg de busulfan pendant 4 jours consécutifs). </li></ol> 3. Isolation des donateurs cellules de moelle osseuse NOTE: Ce protocole a été utilisé avec succès pour isoler et préparer des cellules BM de jusqu&#39;à 5 souris donneuses. Typiquement, le rendement en cellules par souris est d&#39;environ 30 à 40.000.000 BMDCs, ce qui est suffisant pour transplanter 12-16 souris receveuses. Si plus de souris donneuses sont nécessaires le protocole peut être nécessaire d&#39;ajuster en conséquence. <ol><li> Après le dernier jour de busulfan conditionné euthAnizé une souris GFP des bailleurs de fonds (de un à six mois) à l&#39;aide de CO 2 (ou par une autre procédure d&#39;euthanasie accepté à l&#39;établissement). Pour éviter les complications greffés utilisent donateurs syngéniques qui sont du même sexe que les destinataires. </li><li> Pulvériser la souris avec 70% d&#39;éthanol. la peau de se soulever à l&#39;abdomen et ciseaux chirurgicaux utilisant faire une incision à travers la peau de la cavité abdominale jusqu&#39;à la jambe vers la cheville. Maintien du pied, tirez fermement sur la peau de la cheville vers le hip exposant le tissu de la jambe. </li><li> Coupez le muscle et le tissu adipeux du fémur pour exposer l&#39;articulation de la hanche. </li><li> Tout en tirant doucement sur le pied d&#39;étendre la jambe, appuyez sur les ciseaux contre l&#39;articulation de la hanche. Coupez juste au-dessus de la tête du fémur en prenant soin de ne pas couper le fémur lui-même. </li><li> Pour aider à maintenir la stérilité, maintenez la jambe par le pied et nettoyer tout tissu restant des os en frottant la surface de l&#39;os avec des tissus autoclave. </li><li> Séparer le fémur et le tibia en coupant à travers l&#39;articulation du genou etplacer le fémur dans une boîte de culture contenant du PBS stérile. Incuber sur de la glace. </li><li> Retirer et jeter le péroné en coupant sur les points où le péroné se connecte au tibia. Placez le tibia dans la boîte de culture avec le fémur et incuber sur de la glace. </li><li> Répétez les étapes 03.02 à 03.07 pour l&#39;autre jambe, et si nécessaire, souris donneuses supplémentaires. Après l&#39;enlèvement des os, stériliser les instruments chirurgicaux avec un stérilisateur à billes chaud ou utiliser un nouvel ensemble d&#39;outils stériles pour les étapes ultérieures. </li><li> Pour les fémurs, maintenez le fémur avec une pince et l&#39;aide de ciseaux chirurgicaux attentivement &#39;rasage&#39; les extrémités distales de l&#39;os. Retirer aussi peu de l&#39;os nécessaire pour exposer la cavité BM. </li><li> Remplir une seringue avec 3 ml de PBS stérile et fixer une aiguille 23 G. Ennuyer avec précaution l&#39;aiguille dans la cavité BM et rincer la BM dans un plat de culture stérile. Assurez-vous de racler la cavité médullaire avec le point de l&#39;aiguille pour assurer l&#39;élimination de toutes les cellules souhaitées. Après extraction,se assurer que le BM rouge ne est plus visible et l&#39;os blanc apparaît maintenant. </li><li> Répétez les étapes 3.9 à 3.10 pour les fémurs ultérieures, la mise en commun la totalité de la BM dans la même boîte de culture. </li><li> Pour les tibias, maintenez le tibia avec une pince et soigneusement &#39;rasage&#39; la fin où le tibia a été fixée au genou pour exposer la cavité BM. Faire une deuxième coupe, le long de l&#39;os où le BM rouge visible se termine. </li><li> Remplir une seringue avec 3 ml de PBS stérile et fixer une aiguille G 25. Insérez délicatement l&#39;aiguille dans la cavité BM (à partir de la fin qui a été attaché au genou) et rincer la BM dans la boîte de culture contenant la BM dans le fémur. Racler les parois de la cavité avec l&#39;aiguille BM pour éliminer toutes les cellules. Après l&#39;extraction, se assurer que la BM rouge ne est plus visible et l&#39;os apparaît maintenant blanc. </li><li> Répétez les étapes 3.12 à 3.13 pour les tibias ultérieure, la mise en commun la totalité de la BM dans la même boîte de culture. </li><li> Triturer doucement la BM avec une pointe de pipette de 1 ml de dissocier le caunes. </li><li> Faire passer la suspension de cellules à travers un panier filtre 40 uM dans un tube stérile de 50 mL de la centrifugeuse. Rincer le plat avec du PBS pour obtenir toutes les cellules restantes et transférer cette travers le filtre dans le tube de la centrifugeuse. </li><li> Centrifugeuse pendant 5 min à 450 g à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse érythrocytaire. Incuber sur la glace pendant 8,5 min. </li><li> Ajouter ~ 30 ml de PBS stérile pour étancher le tampon de lyse. </li><li> Centrifugeuse pendant 5 min à 450 g à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile. Garder sur la glace. </li><li> Prendre une petite aliquote de l&#39;homogénat cellulaire et diluer avec du PBS (1: 100 pour une souris, 1: 200 pour 2 souris, etc.) pour quantifier le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Diluer la suspension cellulaire à 8 x 10 6 cellules / ml et on incube sur de la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;injection. </li></ol> 4. greffe de moelle osseuse <ol><li> Fill une seringue de 0,5 ml (avec une aiguille de 28 G insuline) avec 300 ul de suspension cellulaire diluée pour chaque souris à injecter. Soyez sûr d&#39;enlever les bulles d&#39;air présentes dans la seringue. </li><li> Placez la cage de la souris contenant les souris receveuses conditionnés sur un coussin chauffant et permettent les veines de la queue à se dilater. </li><li> Prenez une souris receveuse et le placer dans le dispositif de retenue. Essuyez la queue avec de la gaze chirurgicale imbibé d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Tenez fermement le bout et avec le biseau vers le haut, insérez délicatement l&#39;aiguille dans une des veines de la queue latérales et injecter la suspension cellulaire. </li><li> Maintenir gaze chirurgicale sur le site d&#39;injection jusqu&#39;à ce que le saignement se arrête avant l&#39;introduction de la souris dans une nouvelle cage propre. </li></ol> 5. estimer l&#39;étendue des BM chimérisme REMARQUE: les niveaux chimérisme sont généralement variable dans le sang périphérique au 1 semaine post-BMT, et que de tels niveaux de chimérisme sont normalement estimés au moins deux semaines post-BMT. Niveaux de chimerism devrait atteindre&gt; 80% cellules GFP + dans le sang périphérique dans les 3-4 semaines après BMT. <ol><li> Préparer tampon FACS (mM EDTA + 2% de sérum de veau fœtal 2 dans du PBS). REMARQUE: tampon de FACS peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li><li> Placez la souris dans un tube de retenue et de se raser la fourrure sur la jambe postérieure pour exposer la veine saphène latérale. </li><li> Enduisez légèrement la jambe avec de la vaseline et de percer la veine saphène avec une aiguille 25 G. </li><li> Recueillir environ 50 ul de sang avec un tube capillaire revêtue d&#39;héparine. Ajouter le sang dans un tube de micro-centrifugation contenant 1 ml de tampon FACS. Mélanger le tube par inversion et stocker sur la glace. </li><li> Tenez gaze chirurgicale sur le site d&#39;injection jusqu&#39;à saignement se arrête avant de retourner la souris retour à la cage. </li><li> Centrifuger les échantillons de sang pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 500 pl de tampon de lyse érythrocytaire. Incuber sur la glace pendant 8,5 min. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon pour FACS pour étancher le tampon de lyse. </li><li> Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Effectuer une seconde étape de lyse dans 500 ul de tampon de lyse érythrocytaire. Incuber sur la glace pendant 8,5 min. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon pour FACS pour étancher le tampon de lyse. </li><li> Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant. Vérifiez que la pastille est maintenant blanc. NOTE: Si la pastille apparaît toujours rouge, une étape de lyse supplémentaire peut être nécessaire avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Re-suspendre le culot dans 1 ml de tampon FACS. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 900 x g. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Re-suspendre le culot dans 300 pi de tampon FACS et quantifier cellules GFP + par cytométrie de flux (NOTE: A ce stade, aucune immunocoloration souhaitée des cellules peut être effectuée en utilisant des techniques standard, avant de se écouler analyse cytométrique). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Busulfan conditionnement permet la génération de haut niveau BM chimérisme chez la souris avec des cellules hématopoïétiques qui sont facilement détectables. Ce conditionnement peut être effectué sans le besoin d&#39;installations d&#39;irradiation. En outre, la myélosuppression avec les doses de busulfan décrite dans le présent protocole est bien toléré, minimisant les effets secondaires toxiques causés par des doses myéloablatives d&#39;irradiation, et donc peut être une technique plus approprié pour...

Recently, there has been considerable interest in the roles of microglia and bone marrow (BM)-derived cells (BMDCs) in the central nervous system (CNS), both during disease as well as with normal aging. Microglia, the resident immune cells of the CNS, are now known to develop in the CNS following the entry of primitive myeloid progenitors during embryogenesis1. Microglia retain aspects of their myelomonocytic lineage well into adult life. While evidence suggests that the contribution of BMDCs to the microglial pool is minimal in healthy adult animals1, the role BMDCs play in the progression of various neurodegenerative diseases remains unclear. This uncertainty is compounded by the fact that it is difficult to distinguish BMDCs that accumulate within the CNS from endogenous resident microglia, as no universally accepted discriminating immunohistochemical marker has been identified. In order to monitor BMDCs in vivo, we employ a BM transplantation (BMT) protocol whereby endogenous BM cells of a recipient mouse are replaced with those of a donor mouse ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the &#946;-actin promoter. This protocol permits the determination of both the localization and morphology of GFP+ BMDCs within the recipient mouse using immunohistochemistry, and facilitates further characterization of these cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) followed by subsequent biochemical assays. 
For a successful BMT, recipient BM cells need to be ablated (termed myeloablation) in order to generate niche space within the recipient BM to allow for donor cell engraftment. Often, myeloablation is achieved using total body gamma irradiation which induces double strand breaks in DNA that leads to cell death, particularly in actively dividing cells such as hematopoietic progenitor cells2,3. The irradiation protocols are done to induce sufficient BM cell death such that animal lethality results if the recipient animal does not achieve adequate donor cell engraftment from BMT (so called &#8216;lethal irradiation&#8217;). However, irradiation requires a specialized facility and equipment, along with veterinary and animal husbandry resources not available to researchers at all institutions. Furthermore, myeloablative irradiation can cause potentially lethal damage to other tissues, and due to immunosuppresion, irradiated animals are more susceptible to secondary infections3. As such, reduced intensity conditioning (so called &#8216;RIC&#8217; protocols) regimens have been developed that are intended to minimize potentially toxic side effects of the conditioning protocol in patients, particularly for use in at risk populations such as children and the elderly4. 
Some RIC protocols rely upon chemotherapeutics such as busulfan in order to condition the BM compartment. Busulfan is a bifunctional DNA alkylating agent often used clinically as an alternative to irradiation5,6. Notably, busulfan can be safely administered to mice by intraperitoneal (IP) injection and does not require the specialized facilities and equipment necessary to irradiate mice. Busulfan conditioning has been used extensively in our lab7, as well as in several other recent publications8&#8211;11. When doses of 60-100 mg/kg are employed, high degrees of stable chimerism (>80% GFP+ cells) can be established in the peripheral blood and BM7. Importantly, at these doses myeloablation is not complete and as such mice are able to survive without receiving support BM cells (K. Peake, J. Manning, C. Lewis, and C. Krieger, unpublished observations). Moreover, with myelosuppressive busulfan conditioning there is rapid reconstitution of peripheral blood myelomonocytic cells by donor cells. However, the replacement of peripheral blood lymphocytes by donor cells is slower, highlighting the lack of immunosuppression that occurs with 60-100 mg/kg doses of busulfan compared to total body irradiation7. 
We have successfully used busulfan-induced chimerism to investigate BMDCs in wild-type mice, as well as in mouse models of the neurodegenerative disorders amyotrophic lateral sclerosis (ALS)7 and Alzheimer disease. It has been observed that under certain conditions significant numbers of GFP+ BMDCs accumulate within the CNS7,12. Importantly, like myeloablative conditioning with irradiation, busulfan conditioning followed by BMT is sufficient to allow for GFP+ BMDC accumulation within the CNS in both wild-type mice, and mice with neurological disorders7&#8211;11. As a major obstacle in treating neurodegenerative disorders is the ability to get therapeutic molecules from the circulation into the CNS where they can exert beneficial effects, this raises the possibility that BMDCs could be engineered to express therapeutic molecules, and subsequently used as a vehicle to deliver therapeutics to the CNS of busulfan conditioned recipients, a mechanism we are actively investigating. Although we have found that myeloablative conditioning with irradiation leads to greater accumulation of GFP+ BMDCs in the CNS compared to busulfan conditioning7, irradiation may have considerable toxicity in patients with neurodegenerative disorders and in murine models of CNS disease.
While we, and many others, have used BMT models to study BMDCs in neurodegenerative disorders, the ability to largely replace the BM compartment of a recipient mouse with a distinctly identifiable population of BM cells is an invaluable tool for studying various aspects of the hematopoietic system. This includes a wide array of research topics such as hematopoietic lineage development, leukemia, organ transplantation, graft-versus-host disease, and immunobiology.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:224px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Busulfex</td>
			<td style="width:224px;">Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DIN 02240602</td>
			<td>Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10492-01</td>
			<td>Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
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busulfan as a myelosuppressive agent for generating stable high-level bone marrow chimerism in mice

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct biomarker isolated from donor mice. This technique allows for identification of donor-derived hematopoietic cells within the recipient mice, and can be used to isolate and characterize donor cells using various biochemical techniques. BMT typically relies on myeloablative conditioning with total body irradiation to generate niche space within the BM compartment of recipient mice for donor cell engraftment. The protocol we describe here uses myelosuppressive conditioning with the chemotherapeutic agent busulfan. Unlike irradiation, which requires the use of specialized facilities, busulfan conditioning is performed using intraperitoneal injections of 20 mg/kg busulfan until a total dose of 60-100 mg/kg has been administered. Moreover, myeloablative irradiation can have toxic side effects and requires successful engraftment of donor cells for survival of recipient mice. In contrast, busulfan conditioning using these doses is generally well tolerated and mice survive without donor cell support. Donor BM cells are isolated from the femurs and tibiae of mice ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP), and injected into the lateral tail vein of conditioned recipient mice. BM chimerism is estimated by quantifying the number of GFP+ cells within the peripheral blood following BMT. Levels of chimerism&nbsp;>80% are typically observed in the peripheral blood 3-4 weeks post-transplant and remain established for at least 1 year. As with irradiation, conditioning with busulfan and BMT allows for the accumulation of donor BM-derived cells within the central nervous system (CNS), particularly in mouse models of neurodegeneration. This busulfan-mediated CNS accumulation may be more physiological than total body irradiation, as the busulfan treatment is less toxic and CNS inflammation appears to be less extensive. We hypothesize that these cells can be genetically engineered to deliver therapeutics to the CNS.

L&#39;administration de 60 à 100 mg / kg de busulfan est généralement bien toléré par les souris. Toutefois, les animaux perdent généralement du poids pendant la phase de conditionnement (~ 5-10%) et donc l&#39;alimentation peut être complétée avec des friandises telles que les graines de tournesol irradiés pour encourager manger. Les niveaux de chimérisme de&gt; 80% des cellules GFP + dans le sang périphérique et BM doivent être régulièrement réalisable à l&#39;aide de 60 à 100 mg / kg de busulfan <...

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Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.

Busulfan comme agent myélosuppressive pour générer de haut niveau stable de moelle osseuse chez des souris chimérisme

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.1K vues.  Simon Fraser University. We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.