This work was supported by the Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (to KP) and a Neuromuscular Research Partnership Program grant from the CIHR, the ALS Society of Canada, and Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) to CK and FMR. Additional support was also provided by the ALS Society of America (57969). We would like to thank Dr. R. Keith Humphries from the Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada and the staff at the Simon Fraser University Animal Care Unit.

NOTA: Ética Declaración: Este protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Simon Fraser (UACC; permitir números 1037K-12 y 1060K-03) y está en conformidad con el Consejo Canadiense de los Animales, la Guía del NIH para la la Directiva CEE Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y. 1. Consideraciones especiales NOTA: El busulfán es citotóxica. Manipule y deseche de acuerdo a la hoja de datos de seguridad de materiales y directrices institucionales. <ol><li> Realice todas las técnicas asépticamente en una campana de flujo laminar. </li><li> Esterilizar los instrumentos antes de su uso envolviendo en un material de envasado apropiado, tal como un paquete de la cáscara, y tratamiento en autoclave. </li><li> Mientras que el riesgo de infección es menor con busulfán acondicionado en comparación con la irradiación, manejar animales sólo en una campana de flujo laminar para las primeras 2 semanas después del trasplante. </li></ol> 2. Acondicionamiento deLos ratones receptores <ol><li> Diluir busulfán a 3 mg / ml con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). NOTA: Es importante hacer una dilución fresca de busulfán justo antes de su uso cada día de la inyección. </li><li> Administrar 20 mg / kg de busulfan diluida a ratones receptores mediante inyección IP diaria. </li><li> Repetir las inyecciones IP diarias de 20 mg / kg busulfán hasta una dosis total de 60-100 mg / kg ha sido entregado (es decir, para un / kg dosis total de 80 mg, administrar 20 mg / kg de busulfan durante 4 días consecutivos). </li></ol> 3. Aislamiento de células de médula ósea de donantes NOTA: Este protocolo ha sido utilizado con éxito para aislar y preparar células BM de hasta 5 ratones donantes. Típicamente, el rendimiento de células por ratón es de aproximadamente 30-40 million BMDCs, lo cual es suficiente para trasplantar 12-16 ratones receptores. Si se necesitan más ratones donantes puede ser necesario ajustar en consecuencia el protocolo. <ol><li> Tras el último día de busulfán acondicionado euthanize un ratón donante GFP (uno a seis meses de edad) con CO 2 (o por otro procedimiento de eutanasia aceptado en la institución). Para evitar complicaciones injerto utilizan donantes singénicos que son del mismo sexo que los destinatarios. </li><li> Pulverizar ratón con etanol al 70%. La piel de elevación con las tijeras quirúrgicas abdomen y utilizando hacer una incisión a través de la piel de la cavidad abdominal arriba de la pierna hacia el tobillo. Sosteniendo el pie, tire firmemente la piel desde el tobillo hacia la cadera exponiendo el tejido de la pierna. </li><li> Recorte el tejido muscular y grasa del fémur para exponer la articulación de la cadera. </li><li> Mientras tira suavemente con el pie para extender la pierna, pulse la tijera contra la articulación de la cadera. Cortar justo por encima de la cabeza del fémur con cuidado de no cortar el propio fémur. </li><li> Para ayudar a mantener la esterilidad, mantenga la pierna con el pie y limpiar cualquier resto de tejido de los huesos por el roce de la superficie del hueso con tejidos tratados en autoclave. </li><li> Separar el fémur y la tibia mediante el corte a través de la articulación de la rodilla ycolocar el fémur en una placa de cultivo que contiene PBS estéril. Incubar en hielo. </li><li> Retire y deseche el peroné por el corte en los puntos donde el peroné se conecta a la tibia. Coloque la tibia en la placa de cultivo con el fémur y se incuba en hielo. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.7 de la otra pierna, y si es necesario, ratones donantes adicionales. Después de la eliminación de los huesos, esterilizar los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de cuentas caliente o utilizar un nuevo conjunto de herramientas estériles para las etapas ulteriores. </li><li> Para los fémures, mantenga el fémur con pinzas y con unas tijeras quirúrgicas cuidadosamente &#39;afeitado&#39; los extremos distales de los huesos. Retire tan poco del hueso como sea necesario para exponer la cavidad BM. </li><li> Llene una jeringa con 3 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 23. Taladro con cuidado la aguja en la cavidad BM y lave el BM en una placa de cultivo estéril. Asegúrese de raspar la cavidad medular con la punta de la aguja para asegurar la eliminación de todas las células deseadas. Después de la extracción,asegúrese de que el BM rojo ya no es visible y el hueso aparece ahora blanco. </li><li> Repita los pasos 3.9 a 3.10 para fémures posteriores, puesta en común de todo el BM en la misma placa de cultivo. </li><li> Para las tibias, mantenga la tibia con unas pinzas y con cuidado &#39;afeitado&#39; el final, donde la tibia se adjuntó a la rodilla para exponer la cavidad BM. Haga un segundo corte a lo largo del hueso donde termina el BM roja visible. </li><li> Llene una jeringa con 3 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 25. Suavemente inserte la aguja en la cavidad BM (desde el extremo que se adjuntó a la rodilla) y enjuagar el BM en la placa de cultivo que contiene el BM de los fémures. Raspe las paredes de la cavidad BM con la aguja para eliminar todas las células. Después de la extracción, asegúrese de que el BM rojo ya no es visible y el hueso aparece ahora blanco. </li><li> Repita los pasos 3.12 a 3.13 para la posterior tibias, puesta en común de todo el BM en la misma placa de cultivo. </li><li> Tritura suavemente el BM con una punta de pipeta de 1 ml para disociar el cells. </li><li> Pasar la suspensión celular a través de un filtro de cesta 40 mM en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Enjuague el plato con PBS para obtener las células restantes y transferir este a través del filtro en el tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 450 xg a 4 ° C. Retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de los eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min. </li><li> Añadir ~ 30 ml de PBS estéril para saciar el buffer de lisis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 450 xg a 4 ° C. Retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de PBS estéril. Mantener en hielo. </li><li> Tomar una pequeña alícuota del homogeneizado celular y se diluye con PBS (1: 100 para ratón 1; 1: 200 para 2 ratones, etc.) para cuantificar el número de células usando un hemocitómetro. </li><li> Diluir la suspensión de células a 8 x 10 6 células / ml y se incuba en hielo hasta la inyección. </li></ol> 4. Trasplante de Médula Ósea <ol><li> Fill una jeringa de 0,5 ml (con una aguja de insulina 28 G) con 300 l de suspensión celular diluida para cada ratón a inyectar. Asegúrese de eliminar las burbujas de aire presentes en la jeringa. </li><li> Coloque la jaula del ratón contiene los ratones receptores acondicionado en una almohadilla eléctrica y permitir que las venas de la cola se dilaten. </li><li> Tome un ratón receptor y colocar en el dispositivo de retención. Limpiar la cola con una gasa quirúrgica empapada con etanol al 70%. </li><li> Sostenga firmemente la cola y con el bisel hacia arriba, inserte suavemente la aguja en una de las venas de la cola laterales e inyectar la suspensión celular. </li><li> Mantenga gasa quirúrgica en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detiene antes de introducir el ratón en una nueva jaula limpia. </li></ol> 5. Estimación de la Extensión de la BM quimerismo NOTA: Los niveles de quimerismo suelen ser variable en la sangre periférica en 1 semana post-trasplante de médula ósea, y como tal, los niveles de quimerismo normalmente se estiman al menos 2 semanas post-TMO. Los niveles de chimerism debe alcanzar&gt; 80% GFP + células en la sangre periférica dentro de 3-4 semanas después del trasplante de médula ósea. <ol><li> Preparar tampón FACS (mM EDTA suero bovino fetal al 2 + 2% en PBS). NOTA: tampón FACS se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas. </li><li> Coloca el ratón en un tubo de restricción y afeitar el pelo de la pierna posterior para exponer la vena safena lateral. </li><li> Capa finamente la pierna con vaselina y perforar la vena safena con una aguja de 25 G. </li><li> Recoger aproximadamente 50 l de sangre con un tubo capilar recubierto con heparina. Añadir la sangre a un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de tampón FACS. Mezclar el tubo por inversión y almacenar en hielo. </li><li> Mantenga gasa quirúrgica en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detiene antes de volver ratón de nuevo a la jaula. </li><li> Centrifugar las muestras de sangre durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en 500 l de tampón de lisis de los eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min. </li><li> Añadir 1 ml de tampón FACS para saciar el tampón de lisis. </li><li> Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Realizar una segunda etapa de lisis en 500 l de tampón de lisis de eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min. </li><li> Añadir 1 ml de tampón FACS para saciar el tampón de lisis. </li><li> Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante. Compruebe que la pastilla es ahora blanco. NOTA: Si el pellet todavía aparece rojo, puede ser necesaria una etapa de lisis adicional antes de proceder al siguiente paso. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de tampón FACS. Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en 300 l de tampón FACS y cuantificar células GFP + mediante citometría de flujo (NOTA: En este punto cualquier inmunotinción deseada de las células se puede realizar, utilizando técnicas estándar, antes del análisis de citometría de flujo). </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+therapy+with+intravenous+busulfan+and+cyclophosphamide+(IV+BuCy2)+for+hematologic+malignancies+prior+to+allogeneic+stem+cell+transplantation:+a+phase+II+study.">Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+concentrations+of+busulfan+during+high-dose+therapy.">Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy.</a> Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).</li><li>Hassan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+[11C]-busulfan+in+cynomolgus+monkey+and+in+the+brain+of+a+human+patient.">In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion.">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Harrison, D. 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The authors have nothing to disclose.

Acondicionado Busulfan permite la generación de alto nivel de quimerismo BM en ratones con células hematopoyéticas que son fácilmente detectable. Este acondicionamiento se puede realizar sin la necesidad de instalaciones de irradiación. Además, la mielosupresión con las dosis de busulfán se describe en este protocolo es bien tolerada, se minimizan los efectos secundarios tóxicos provocados por dosis mieloablativos de la irradiación, y por lo tanto puede ser una técnica más adecuada para generar BM quimerismo...

Recently, there has been considerable interest in the roles of microglia and bone marrow (BM)-derived cells (BMDCs) in the central nervous system (CNS), both during disease as well as with normal aging. Microglia, the resident immune cells of the CNS, are now known to develop in the CNS following the entry of primitive myeloid progenitors during embryogenesis1. Microglia retain aspects of their myelomonocytic lineage well into adult life. While evidence suggests that the contribution of BMDCs to the microglial pool is minimal in healthy adult animals1, the role BMDCs play in the progression of various neurodegenerative diseases remains unclear. This uncertainty is compounded by the fact that it is difficult to distinguish BMDCs that accumulate within the CNS from endogenous resident microglia, as no universally accepted discriminating immunohistochemical marker has been identified. In order to monitor BMDCs in vivo, we employ a BM transplantation (BMT) protocol whereby endogenous BM cells of a recipient mouse are replaced with those of a donor mouse ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the &#946;-actin promoter. This protocol permits the determination of both the localization and morphology of GFP+ BMDCs within the recipient mouse using immunohistochemistry, and facilitates further characterization of these cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) followed by subsequent biochemical assays. 
For a successful BMT, recipient BM cells need to be ablated (termed myeloablation) in order to generate niche space within the recipient BM to allow for donor cell engraftment. Often, myeloablation is achieved using total body gamma irradiation which induces double strand breaks in DNA that leads to cell death, particularly in actively dividing cells such as hematopoietic progenitor cells2,3. The irradiation protocols are done to induce sufficient BM cell death such that animal lethality results if the recipient animal does not achieve adequate donor cell engraftment from BMT (so called &#8216;lethal irradiation&#8217;). However, irradiation requires a specialized facility and equipment, along with veterinary and animal husbandry resources not available to researchers at all institutions. Furthermore, myeloablative irradiation can cause potentially lethal damage to other tissues, and due to immunosuppresion, irradiated animals are more susceptible to secondary infections3. As such, reduced intensity conditioning (so called &#8216;RIC&#8217; protocols) regimens have been developed that are intended to minimize potentially toxic side effects of the conditioning protocol in patients, particularly for use in at risk populations such as children and the elderly4. 
Some RIC protocols rely upon chemotherapeutics such as busulfan in order to condition the BM compartment. Busulfan is a bifunctional DNA alkylating agent often used clinically as an alternative to irradiation5,6. Notably, busulfan can be safely administered to mice by intraperitoneal (IP) injection and does not require the specialized facilities and equipment necessary to irradiate mice. Busulfan conditioning has been used extensively in our lab7, as well as in several other recent publications8&#8211;11. When doses of 60-100 mg/kg are employed, high degrees of stable chimerism (>80% GFP+ cells) can be established in the peripheral blood and BM7. Importantly, at these doses myeloablation is not complete and as such mice are able to survive without receiving support BM cells (K. Peake, J. Manning, C. Lewis, and C. Krieger, unpublished observations). Moreover, with myelosuppressive busulfan conditioning there is rapid reconstitution of peripheral blood myelomonocytic cells by donor cells. However, the replacement of peripheral blood lymphocytes by donor cells is slower, highlighting the lack of immunosuppression that occurs with 60-100 mg/kg doses of busulfan compared to total body irradiation7. 
We have successfully used busulfan-induced chimerism to investigate BMDCs in wild-type mice, as well as in mouse models of the neurodegenerative disorders amyotrophic lateral sclerosis (ALS)7 and Alzheimer disease. It has been observed that under certain conditions significant numbers of GFP+ BMDCs accumulate within the CNS7,12. Importantly, like myeloablative conditioning with irradiation, busulfan conditioning followed by BMT is sufficient to allow for GFP+ BMDC accumulation within the CNS in both wild-type mice, and mice with neurological disorders7&#8211;11. As a major obstacle in treating neurodegenerative disorders is the ability to get therapeutic molecules from the circulation into the CNS where they can exert beneficial effects, this raises the possibility that BMDCs could be engineered to express therapeutic molecules, and subsequently used as a vehicle to deliver therapeutics to the CNS of busulfan conditioned recipients, a mechanism we are actively investigating. Although we have found that myeloablative conditioning with irradiation leads to greater accumulation of GFP+ BMDCs in the CNS compared to busulfan conditioning7, irradiation may have considerable toxicity in patients with neurodegenerative disorders and in murine models of CNS disease.
While we, and many others, have used BMT models to study BMDCs in neurodegenerative disorders, the ability to largely replace the BM compartment of a recipient mouse with a distinctly identifiable population of BM cells is an invaluable tool for studying various aspects of the hematopoietic system. This includes a wide array of research topics such as hematopoietic lineage development, leukemia, organ transplantation, graft-versus-host disease, and immunobiology.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:224px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Busulfex</td>
			<td style="width:224px;">Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DIN 02240602</td>
			<td>Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10492-01</td>
			<td>Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:224px;">Life Technologies</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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busulfan as a myelosuppressive agent for generating stable high-level bone marrow chimerism in mice

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct biomarker isolated from donor mice. This technique allows for identification of donor-derived hematopoietic cells within the recipient mice, and can be used to isolate and characterize donor cells using various biochemical techniques. BMT typically relies on myeloablative conditioning with total body irradiation to generate niche space within the BM compartment of recipient mice for donor cell engraftment. The protocol we describe here uses myelosuppressive conditioning with the chemotherapeutic agent busulfan. Unlike irradiation, which requires the use of specialized facilities, busulfan conditioning is performed using intraperitoneal injections of 20 mg/kg busulfan until a total dose of 60-100 mg/kg has been administered. Moreover, myeloablative irradiation can have toxic side effects and requires successful engraftment of donor cells for survival of recipient mice. In contrast, busulfan conditioning using these doses is generally well tolerated and mice survive without donor cell support. Donor BM cells are isolated from the femurs and tibiae of mice ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP), and injected into the lateral tail vein of conditioned recipient mice. BM chimerism is estimated by quantifying the number of GFP+ cells within the peripheral blood following BMT. Levels of chimerism&nbsp;>80% are typically observed in the peripheral blood 3-4 weeks post-transplant and remain established for at least 1 year. As with irradiation, conditioning with busulfan and BMT allows for the accumulation of donor BM-derived cells within the central nervous system (CNS), particularly in mouse models of neurodegeneration. This busulfan-mediated CNS accumulation may be more physiological than total body irradiation, as the busulfan treatment is less toxic and CNS inflammation appears to be less extensive. We hypothesize that these cells can be genetically engineered to deliver therapeutics to the CNS.

La administración de 60-100 mg / kg de busulfan es generalmente bien tolerada por los ratones. Sin embargo, los animales suelen perder peso durante la fase de acondicionamiento (~ 10.5%) y por lo tanto la dieta puede ser necesario complementar con golosinas como las semillas de girasol irradiadas para promover la alimentación. Los niveles de quimerismo de&gt; 80% GFP + células en la sangre periférica y BM deben ser sistemáticamente alcanzable utilizando 60-100 mg / kg busulfán 7. Nuestro laboratorio ha ...

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Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.

El busulfán como agente mielosupresor para Generación estable de alto nivel de Médula Ósea quimerismo en ratones

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.1K vistas.  Simon Fraser University. We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.